类器官（Organoid）是一种在体外利用胚胎干细胞或者成体干细胞培养出的三维细胞培养物，它与人体器官具有相似的组织学特征。类器官最重要的特性是在体外培养环境中干细胞具有高度组织记忆和自我组装能力，能够自己长成类似于体内组织的结构，高度还原体内器官的细胞构成和功能。
近十年来，干细胞和3D细胞培养技术的进步重新点燃了人们对类器官研究的兴趣。2013年，Science将类器官评为年度十大技术；2015年，MIT科技评论类器官为当年十大科技突破之一；2017年，Nature Method将类器官评为年度最佳方法；2019年，新英格兰医学杂志将类器官评为优良的临床前疾病模型。类器官来源于干细胞，如人类多能干细胞（hPSC）或干细胞/祖细胞，由能够自组织的不同细胞类型组成，形成3D结构，旨在成为器官的微型模拟物。研究探索并强调了类器官在模拟复杂的人类疾病、了解人类发育和再生医学领域的巨大潜力。实验室中可以制造出类似于不同人体器官的各种类器官——脑、视网膜、胃、食道、肺、小肠、肝脏、胰腺、肾脏、血管等。
目前的类器官培养严重依赖动物来源的细胞外基质（ECM），如Matrigel。然而，Matrigel的成分是不确定的，批次之间存在差异。这种ECM基质的不一致极大地限制了当前类器官模型的可重复性，并且不适合临床应用。此外，传统的类器官培养方法通常从hPSC单层培养开始，其中单层hPSC以单细胞或小细胞簇的形式收获，并在3D培养物中聚集。目前的类器官培养方法存在几个关键的局限性：首先，动物源性基质不稳定，不适合临床应用。其次，使用传统的2D单层培养方法从冻存复苏的hPSCs通常会导致细胞活力低。接下来，将hPSC集落解离为单细胞是一种苛刻的技术，它将大大降低细胞活力，从而损害形成的hPSC聚集体的质量。最后，这种传统方法的可扩展性有限。这是大规模、3D生产hPSC和类器官的主要障碍，这对于类器官作为临床治疗药物的发展至关重要。因此，迫切需要一种方法，使得类器官分化容易且快捷，同时易于大规模生产，并保持细胞的高质量。
一种无异源水凝胶可以很好地解决动物源基质的问题，VitroGel STEM 和VitroGel ORGANOID从 hPSC 生成和培养中肠/后肠和类器官（图 1）。
图1 无异源 3D 类器官工作流程概述 – 从 iPSC 球状体开始，进行干细胞分化和类器官形成
可以从单层hPSC甚至直接从冻存的hPSC快速轻松地生成3D hPSC球状体，只需将这些细胞与VitroGel STEM混合即可（图2）。在三天内形成hPSC球状体，可以使用相同的水凝胶3D培养系统分化为中肠/后肠，并进一步用VitroGel ORGANOID生成类器官。
图2 通过将 hPSC 与VitroGel STEM 与 3D 静态悬浮培养方法混合来生成 3D hPSC 球状体
VitroGel STEM和VitroGel ORGANOID均不含异源成分，可提供强大的细胞扩增和分化支撑。VitroGel可以克服当前用于干细胞培养和类器官生成的ECM的缺点 ：
✦ VitroGel无异源而且稳定，适用于下游临床应用；
✦ VitroGel STEM能够提高液氮冻存hPSCs复苏的细胞活力；
✦ VitroGel水凝胶具有高度可扩展性，支持干细胞的大规模扩增，甚至是类器官的生产。
VitroGel水凝胶可以提高生成的类器官的质量和可重复性，以及干细胞的活力。
# 材料和方法 #
一、从冻存复苏或2D培养的 hPSC 形成 3D 细胞球
VitroGel STEM能够支持冻存hPSC复苏培养和扩增，形成3D hPSC细胞球状体（图3）。传统方法需要在hPSC细胞复苏和稳定后，在基质上多次传代培养。在复苏过程中，保持复苏的hPSC的活力通常具有挑战性。然而，VitroGel STEM消除这一困难，可以直接从液氮中取出细胞复苏进行培养，保持高的细胞活力，产生3D细胞球。
图3 直接将储存在液氮（LN2）中的hPSC用于三维静态悬浮培养
A、直接从储存在液氮中的细胞形成的 hPSC 球状体从第 1 天到第 6 天连续生长。B、碱性磷酸酶（AP）染色表明这些球状体是健康的，hPSC活性高。
3D 细胞球形成：
1、将VitroGel STEM恢复至室温或37°C。
2、细胞复苏后，离心去除冻存液。
3、用 10 μM/mL ROCK 抑制剂 Y-27632 * 在干细胞培养基中制备细胞悬液。
4、以 2:1 （v/v） 的比例轻轻混合VitroGel STEM 与细胞悬液。（查看表1或表2不同培养周期不同培养容器的推荐体积）
5、将含有 10 μM/mL Y-27632 的干细胞培养基以 5:1 （v/v） 的比例加入细胞-水凝胶混合物中。该比率对于确保hPSC球状体的良好形成至关重要。小心地吹打，使培养基和混合物均匀混合**。
6、将所需体积的混合物添加到培养容器中，并在37°C，5% CO2的条件下孵育（见表1和表2）。
7、为7天培养周期添加培养基：在第3天或第4天，将所需体积的干细胞培养基（不含Y-27632）直接添加到培养容器中（参见表1中的“Additional medium”体积）。
* 推荐的细胞密度为 0.2-5 X 106 个细胞/mL，水凝胶悬浮培养物中的最终细胞接种密度约为 0.1-5 X 105 个细胞/mL。细胞接种密度应针对单个细胞类型进行优化，并且还取决于所需的干细胞球状体的最终大小。
**干细胞培养基和细胞-水凝胶混合物的混合比例可以在1:1至20:1 v/v比例之间调节，具体取决于最终混合物的所需粘度和培养条件。如果混合比高于5:1 v/v，则可能需要轨道振荡器或离心瓶，并将其设置为10-40 rpm的速度以维持细胞悬液的状态。
注意：3D hPSC 球状体也可以由在常规 2D 单层中培养的 hPSC 制成。如果使用单层hPSC培养物，请使用合适的解离试剂（根据制造商的建议）解离细胞，然后从步骤3开始继续。
表 1 推荐7天培养周期的体积
表 2 推荐3-4天培养周期的体积
二、3D 内胚层和中/后肠分化与VitroGel STEM
收集hPSC球状体并通过以下方式分化为内胚层：
1、用移液管将 hPSC 球状体转移到离心管中。
2、100 x g 离心3分钟。
3、小心地除去上清液和水凝胶层，收集细胞沉淀（图4）。
图4 离心后离心管中的水凝胶层和细胞沉淀图
注意：或者，可以使用VitroGel细胞回收溶液的改良无酶细胞回收方法*（查看下面的使用VitroGel®细胞回收溶液进行细胞收获的方案）。
4、用内胚层分化培养基重悬hPSC球状体。
5、将VitroGel STEM与hPSC球状体悬浮液以 2:1 （v/v） 的比例混合。
6、将额外的内胚层培养基与步骤5中的细胞 - 水凝胶混合物以5:1（v/v）的比例混合以进行悬浮培养3天。（不同培养容器的推荐体积见表2）
7、3天后，通过重复步骤1-3收获内胚层球状体。
8、在中/后肠分化培养基中制备内胚层球状体悬浮液。
9、将VitroGel STEM与hPSC球状体悬浮液以 2:1 （v/v） 的比例混合。
10、将额外的中/后肠培养基与步骤9中的细胞 - 水凝胶混合物以5:1（v/v）的比例混合用于悬浮培养2-4天。（不同培养容器的推荐体积见表2）
三、VitroGel细胞回收溶液进行细胞收获
1、将VitroGel细胞回收溶液（2-5X体积）直接添加到培养板或培养管中（图5）。
2、摇晃或吹打 3-5 次混匀。
3、37°C 下孵育 3-5 分钟。
4、转移到离心管中， 100 x g 离心3-5分钟。
5、小心地除去上清液和水凝胶层，收集细胞沉淀（图4）。
图5 使用VitroGel细胞回收溶液收获球状体
四、类器官的形成和成熟
收集中/后肠球状体，并通过以下方式形成类器官：
1、使用移液管将中肠/后肠球体从培养物转移到离心管中。
2、100 x g 离心3分钟。
3、小心地去除上清液和水凝胶层，收集细胞沉淀（图4）。
4、将VitroGel ORGANOID置于室温或加热至37°C。
5、将 1 mL VitroGel ORGANOID加入 500 μL 细胞悬液中，小心吹打 5-10 次以彻底混合（保持VitroGel和细胞悬液的混合比例为 2:1 v/v）
注意：如果水凝胶中需要关键的生长因子，如R-spondin，Noggin或EGF来支持类器官培养，请用3倍关键生长因子制备细胞悬液（有关详细信息，请查看VitroGel®ORGANOID操作指南 ）。
6、将水凝胶混合物转移到孔板中。轻轻倾斜/旋转孔板，以确保均匀覆盖每个孔的底部。
下面列出不同培养板的水凝胶推荐体积。
7、混合物置于在室温下稳定10-15分钟。
8、添加培养基小心地覆盖水凝胶。
9、下面列出不同培养板的推荐体积：
10、将培养板放入培养箱中，并根据实验方案更换覆盖培养基。
注意：更换50-80%的覆盖培养基。如果在类器官培养过程中切换到其他培养基，请 100% 更换覆盖培养基。避免在更换培养基期间干扰水凝胶。
图6 类器官可以通过将球状体/细胞与VitroGel ORGANOID混合来形成类器官
# 结果和讨论 #
一、VitroGel STEM维持hPSC的多能性
培养hPSC的关键问题之一是不必要的自发分化，导致多能性丧失。由于分化细胞群的纯度降低，这将对基因编辑、组织类器官开发、细胞重编程、生化测定和 DNA/RNA 测序等下游应用产生影响。这在基于干细胞的疗法中具有重要的意义， 分化细胞的纯度对于恢复组织功能至关重要。在VitroGel STEM 中培养 3 天的 3D hPSC 球体上免疫荧光染色显示，3D hPSC 球状体保留了多能性标志物 SSEA、OCT4、SOX2 和 TRA-1-60 的高表达水平（图7）。
图7 3D hPSC 球状体中关键多能标记物的表达。（上）3天后，形成约100 μM的hPSC球状体。（下）高质量的hPSC球状体在3 d内形成，并表达关键的多能性标志物SSEA4、OCT4、SOX2和TRA-1-60。
二、hPSC 球状体分化为中/后肠类器官
hPSC球状体很容易分化为内胚层。在第3天，收获hPSC球状体并在VitroGel STEM中用内胚层分化培养基传代培养。到第6天，产生约200 μM的内胚层球状体（图8）。内胚层球状体呈致密球形。然后收获内胚层球状体，并在VitroGel ORGANOID中用中/后肠分化培养基传代培养。中肠/后肠分化一天后，类器官的总体形态发生剧烈变化（图8，第7天），类器官的表面似乎更“不规则”，表明细胞“出芽”，这是上皮组织的共同特征。到第8天，形成更多的上皮“芽”。免疫荧光成像证实，这些类器官表达关键的上皮标志物E-Cadherin和中/后肠标志物CDX2（图8）。
VitroGel水凝胶的创新方法产生了高质量的hPSC球状体以及类器官。球状体和类器官的大小是均匀一致的。此外，VitroGel水凝胶支持中/后肠类器官的进一步分化和成熟。
图8 分化过程中内胚层球状体（第 6 天）和中/后肠（第 7 天和第 8 天）类器官的形态。（上）分化过程中内胚层球状体（第6天）和中/后肠（第7天和第8天）类器官的形态。（下）中/后肠类器官表达关键标志物CDX2和上皮标志物E-Cadherin。
三、VitroGel ORGANOID 支持中/后肠类器官的长期培养和成熟
在第9天确认中肠/后肠的形成后，收获细胞并将中肠/后肠与VitroGel ORGANOID混合以进行类器官的形成和成熟（图9）。VitroGel ORGANOID能够促进类器官长期培养。到第16天，类器官的尺寸增加，上皮芽明显增多，这表明类器官进一步生长和成熟。
图9 VitroGel ORGANOID形成中/后肠类器官
总之，这项研究表明VitroGel STEM可用于培养和维持hPSCs 3D球状体。甚至可以在从冻存中立即复苏并形成球状体后促进hPSC细胞的恢复。使用VitroGel STEM形成的3D hPSC球状体表达高水平的关键多能性标志物， 保持了hPSC的高质量。形成的hPSC球状体可以很容易地分化成类器官。VitroGel ORGANOID能够有效地促进类器官的进一步生长和发育，从而实现这些类器官的长期高质量培养。研究表明，VitroGel STEM和VitroGel ORGANOID有效地简化类器官分化过程，培养的类器官均一性高， 可重复性高，提高了下游检测的成功率。
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