细胞培养的维度提升到三维，更加能够模拟体内细胞的生长环境。围绕细胞的三维培养也涌现了很多新鲜的产品，生物工艺开发、优化和放大已经成为主流趋势。其中在细胞培养灌流工艺中，营养物质被不断加入到生物反应器中，与此同时细胞生长代谢的产物通过截留装置与目的产物分离，可以保证细胞一直处于最佳的生长环境中，从而获得高细胞密度或高浓度细胞产物。中空纤维细胞培养系统（FiberCell系统）是一种可以在常规实验室内实现生物工艺放大中的小试生产高浓度细胞产物，可以满足基础科研中蛋白生产、外泌体富集、药代学/药动学等研究。充分利用系统的优势，为实验室研究“降本增效”。
图1 FiberCell系统置于培养箱内的实物图
FiberCell系统工作原理
● 蠕动泵、培养筒、培养基储液瓶通过导管连接构成一个连续流动的体系。
● 中空纤维作用类似于微血管，纤维直径大约200 μm，可选择不同截留分子量的纤维。
● 培养基在中空纤维内部循环流动，细胞接种培养在纤维外部；中空纤维可允许小分子营养物质自由穿透。
● 细胞在纤维外生长时，分泌的产物聚集在纤维外空间，浓度可高于2D培养的10-100倍。
图2 FiberCell系统运行动态图
FiberCell系统热门应用举例
1、外泌体富集
Yan等利用FiberCell系统进行3D培养脐带MSC收获外泌体，再与2D培养获得的外泌体进行动物临床研究比较。结果发现3D-外泌体的产量是2D-外泌体的7.5倍；体外研究表明两种方式获得的外泌体均能刺激软骨细胞增殖、迁移和机制合成，抑制细胞凋亡，其中3D-外泌体的作用强于2D-外泌体，治疗效果更好。
图3 FiberCell系统高产外泌体（左）；不同培养方式获得的外泌体在软骨缺损修复中的治疗效果比较（右）
2、单抗或重组蛋白生产
实验室内通过动物模型收获小鼠腹水再纯化获取单克隆抗体，生产规模小，周期长，动物个体的差异也会导致蛋白的差异。如何在有限空间与时间内达到小规模或者商业化地生产单克隆抗体或者重组蛋白来满足科学研究，FiberCell系统可在培养箱内实现小规模持续生产，大大缩短生产周期与纯化成本。另外搭配无蛋白、化学合成的血清替代物CDM-HD，提高表达蛋白的纯度与一致性。
图4 SDS-PAGE分析上清中重组蛋白M5114的表达情况
3、体外PK/PD模型
体外PK/PD模型是指借助体外装置来模拟药物在体内的药代动力学过程和药效动力学的研究方法。与传统的抗菌药物药效学研究方法相比，该模型能够直接体现体内抗菌药物动态变化过程中与细菌或细胞的相互作用，且不受实验动物的限制。FiberCell系统可以实现单一药物或同时两种药物的PK/PD模型，更精确地监控剂量和代谢状况。欧洲药品管理局（EMA）已批准中空纤维感染模型用于体外毒性测试，得到的抗生素药物数据可以直接用于临床申报。
图5 FiberCell系统用于体外PK/PD模型的模式图
FiberCell系统常见问题
1、FiberCell相比于T型Flasks、滚瓶、培养袋的优势在哪里？
FiberCell系统可以良好地模拟哺乳动物体内循环系统应用，体外运行可以让研究更简单、更高效、更具成本效益。当然以低密度悬浮培养或二维烧瓶为基础的研究，血清体系的使用并不是真正生理性质的，对二维培养是较为适用的，但缺乏生物学相关的特性，也不是细胞最佳的生长方式。而FiberCell系统在体外提供了一个更加接近于体内的三维环境，可持续收获产物用于下游研究，有效改善蛋白质折叠与均匀的翻译后修饰，可高效表达蛋白。
图6 培养相同细胞量时消耗的T Flasks与FiberCell系统的比较
2、FiberCell系统该使用什么培养体系？如何适应无血清培养基？
1) FiberCell系统拥有“高密度细胞培养、收获高浓度细胞产物”的特点，例C2011型号的培养筒至少需要接种1*10^8 cell，这些细胞在系统内会形成它们自己的微环境，建议高密度细胞培养时，基础培养基的葡萄糖含量至少为3.5 g/L，若是1.0 g/L低糖水平很难维持。
2) 使用基础培养基加血清可以在中央储液室中运行，即纤维内空间进行循环以提供给纤维外空间细胞相关营养物质等。如果需要排除血清外源性蛋白或外泌体等干扰，请在细胞稳定消耗葡萄糖后，缓慢撤去血清或缓慢转换添加CDM-HD（Chemically Defined Medium-High Density）等无血清添加物。待细胞适应新培养基或无血清培养基后，可以开展相关产物的收获。
3、若细胞状态不佳，是否可以重复使用培养筒或在同一培养内重新接种细胞吗？
1) 培养筒如果没有发生污染，可以尝试同一培养筒内重新接种同类细胞，但需要在接种前将状态不佳的细胞清除，使用物理吹打方式或胰酶消化方式均可行，暂时无法保证细胞是否清除彻底。
2) 重新接种细胞后，仍需要正常监测细胞消耗葡萄糖的情况。如能够正常消耗，可继续开展收获工作；如不能正常消耗，则需要更换新的培养筒。
3) 培养筒不建议高压灭菌。
4、关于FiberCell系统培养基颜色变化的情况说明。
1) 当培养基中葡萄糖水平下降到50%以后，产生很多细胞代谢废物或乳酸等，培养基的颜色会变成淡黄色或橘黄色需及时更换中央储液室的培养基。
2) 当培养基的颜色变为深红色，需要了解下培养箱的CO2浓度是否正确。
3) 如果系统的内外空间培养基颜色都变黄、粉色或浑浊，或者在纤维外空间的接口处出现白色丝状物等，可能存在细菌或真菌污染，需要舍弃该套培养筒。
5、关于FiberCell系统中培养筒的使用寿命的说明。
1) FiberCell系统应用在神经胶质瘤细胞培养持续时间为560天。另外应用在杂交瘤细胞培养，近一年的收获的抗体特征基本无变化。
2) 可尝试每周至少一次反向过滤收获的操作，有助于纤维孔径的通畅。
3) 时刻注意无菌操作，一旦发生微生物污染，培养筒就需要舍弃。
*更多关于FiberCell系统的FAQ可以咨询逍鹏生物技术支持。
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