荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）技术通过应用非放射性荧光物质标记的核酸探针杂交原理，获得细胞内多条染色体（或染色体片段）或多种基因状态的信息。该技术具有安全，快速，灵敏度高等特点，目前已广泛应用于肿瘤生物学，细胞遗传学，基因扩增、基因定位，基因作图以及分子诊断等领域。
下面，我们就荧光原位杂交实验中的关键点进行逐一讲解。
取材
取材应尽可能新鲜。由于RNA降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30min内固定。
固定
固定的目的是很大限度地保持细胞内DNA或RNA水平。较常用的固定剂是多聚甲醛，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞。
通透
1、稀酸或酸酐处理
为防止探针与组织中的碱性蛋白之间产生静电结合，从而降低背景，杂交前的标本可用0.25%的乙酸酐处理，经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。组织或细胞标本亦可用0.2M HCl处理，稀酸能使碱性蛋白变性，再结合蛋白酶消化，可将碱性蛋白去除。
2、去污剂处理
去污剂处理的目的是增加组织的通透性，利于杂交探针进入组织细胞，较常用的去污剂是Triton X-100。需要注意的是，过度的去污剂处理不仅影响组织的形态结构，而且还会引起靶核酸的丢失。
3、蛋白酶处理
蛋白酶消化能使固定后被遮蔽的靶核酸暴露，从而增加探针与靶核酸的接触，常用的蛋白酶有蛋白酶K（proteinase K），链霉蛋白酶（pronase）和胃蛋白酶（pepsin）。
杂交缓冲液孵育
杂交前用不含探针的杂交缓冲液在杂交温度下孵育，可以阻断玻片和标本中可能与探针产生非特异性结合的位点，达到减低背景的目的。
变性
进行杂交反应时，探针和靶核酸都必须是单链的，因此双链DNA探针在杂交前必须进行变性，并且探针变性后要立即进行杂交反应，不然解链的探针又会重新复性。
探针的选择
选择探针的基本原则是有高度的特异性。根据探针的来源可分为，基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针。DNA探针、RNA探针在合成时需要控制探针片段长度，通常在300-1000bp左右，DNA探针在杂交过程中可能会出现探针双链之间退火，也更容易在溶液中形成大分子的探针聚合体，从而影响其渗透能力，RNA探针因其单链、高分子结合力、可适应高温杂交的特性，其检测特异性和灵敏度均优于DNA探针。寡核苷酸探针的长度较短，避免了探针内部退火的问题，杂交时的渗透能力也更好。以上每种探针都有各自的优缺点，可根据具体的实验进行选择。
探针的长度、浓度
探针的长度和浓度也是我们选择探针时需要考虑的因素。
1、探针的长度
一般应在50-300个碱基之间，最长不宜超过400个碱基。探针过长，不容易进入细胞；过短，特异性不高。
2、 探针的浓度
探针的浓度依其种类和实验要求略有不同，一般为0.5-5.0μg/mL。最适宜的探针浓度要通过预实验才能确定。探针浓度过高会造成背景染色加深，浓度过低会导致荧光信号不足。
探针标记
这里主要介绍荧光标记染料，包括以下几种：
1、荧光素类染料
荧光素类染料包括标准荧光素及其衍生物，如异硫*酸荧光素（FITC）、羟基荧光素（FAM）、四氯荧光素（TET）等，其中FITC是较常用的一种荧光素染料。
2、罗丹明类染料
罗丹明类染料（rhodamine dye）也是常用的蛋白质分析染料之一，主要包括R101、四乙基罗丹明（RB200）和羧基四甲基罗丹明（TAMRA）等。与荧光素类染料相比，罗丹明类具有更强的光稳定性、更高的荧光产量和更低的pH敏感性。
3、菁染料
目前应用比较广泛的菁标记染料主要有两类，一类是噻唑橙（thiazole orange, TO）、噁唑橙（oxazole orange, YO）系列及其二聚体染料，另一类是多甲川系列菁染料。
4、其他荧光染料
二苯乙烯、萘酰亚胺、香豆素类、吖啶类、芘类等。
直标型探针和间标型探针
直标型探针是指DNA探针直接与荧光素基团共价连接，间标型探针则是指DNA探针先与半抗原（生物素、地高辛）连接，然后半抗原再与荧光素基团连接从而形成探针－半抗原－荧光素基团这种类似“三明治”的复合物。与间标型探针相比，直标型探针具有低背景、高特异性、简单、性价比高等特点，并且随着荧光染料和荧光检测技术的不断发展，直标型探针的灵敏度也在不断提高。在FISH检测领域，尤其是在疾病分型领域，探针大多采用直标型设计。
杂交温度、时间
杂交温度是杂交能否成功的一个关键因素。较佳的措施是使用一些FISH的专用仪器进行操作。如果是手工操作，首先需要对可能使用到的仪器进行温控能力的检查，如水浴锅、孵箱（疾病诊断中的探针要求温控精度在0.5度以内）。其次，要尽可能地保持操作环境温度在20度以上，这对于在冬季进行的FISH操作尤为重要。此外对于需要预热以达到要求温度的试剂，在使用前必须使用温度计对其进行测温。最后，操作者往往会忽视一些小部件的温度，诸如载玻片和盖玻片，尤其是在冬季，盖玻片本身的温度就低，加之探针的量不多，如果没有事先预热盖玻片就会使杂交液的温度急剧下降，严重影响探针和目标DNA的杂交效率。
杂交时间对结果的影响也较大。杂交时间过短会造成杂交不完全，过长则会增加非特异性杂交。大部分的DNA探针杂交时间为2-4hr，但是为了稳妥起见，一般将反应时间定为16-20hr。杂交反应的时间应当与探针的长度和细胞通透性有关，在充分进行通透性处理之后，寡核苷酸探针只需要2-6hr便可完成杂交。
降低背景
荧光原位杂交中背景染色是由多种因素造成的，杂交后的洗涤能够降低背景染色。预杂交也是降低背景染色的一种有效手段，预杂交液与杂交液的区别在于前者不含有探针，杂交液中加入适量的甲酰胺，可避免因杂交温度过高而引起的组织形态结构的破坏以及标本的脱落；硫酸葡聚糖能与水结合，减少杂交液的有效容积，从而提高探针的有效浓度，以达到提高杂交率的目的；在杂交液中加入牛血清白蛋白及载体DNA或RNA等，可以阻断探针与组织结构成分之间的非特异性结合，从而减低背景。另外，强烈建议使用灭菌去离子水配制各种所需的试剂，配制后使用pH计检测是否符合要求。每次FISH均使用新的试剂，旧的试剂最好弃置不用。洗脱液和变性液当天用当天配。最后，防止污染，由于在手指皮肤及实验室用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，为防止其影响实验结果，在整个杂交前处理过程中都需要戴消毒手套，实验所用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温烘烤(180℃)以达到消除RNA酶的目的。
参考文献：
江冬瑞, 王弦, 吴强. 荧光原位杂交技术操作的常见问题分析. 临床与实验病理学杂志. 2015;31(12):1426-1427.
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