Vi-CELL BLU细胞计数和活率分析仪最少仅需170uL样品体积即可得到细胞密度和活率结果。为了准确分析不同细胞，Vi-CELL BLU提供了创建和优化自定义Cell Type设置的功能。本文我们拿容易团聚的HEK293细胞给大家介绍下Cell Type的设置是如何影响样品的处理和图像分析。

在分析团聚细胞时，Cell Type设置中首先会使用到的参数是Decluster degree，我们可以设置为None，Low，Medium或High，并且使用更靠后的值会增加软件对团聚细胞的识别能力。

当出现过多的团聚，我们还需要考虑增加对样品的Aspiration和Mixing Cycles次数。在每次Aspiration过程中，细胞样品会在样品管和注射器之间来回吹打混悬。对于那些很难混悬分散或倾向于粘到样品杯壁上的细胞样品，建议使用这种方法。在Mixing Cycle过程中，台盼蓝和细胞样品一起在样品管和注射器之间来回混匀。增加Mixing Cycles次数会让台盼蓝混匀地更好。Vi-CELL BLU细胞计数和活率分析仪的设计降低了剪切力对细胞的伤害。另外，低剪切力可以提高结果的重现性。但增加Aspiration或Mixing Cycles会提高额外剪切力，从而对比较脆弱的细胞产生潜在的危害。但是，对于团聚细胞系，这些额外的剪切力则可以用于破坏细胞的团聚。

Decluster degree和Aspiration/Mixing Cycles之间重要的区别在于它们是在哪个时刻影响的分析结果。Decluster degree只对测试结束后保存在软件上的细胞照片根据不同设置的Decuster degree重新进行分析。而Aspiration和Mixing Cycles是在拍照前对细胞样品就产生了影响，测试结束后无法再修改Aspiration和Mixing Cycles数值，得到再分析的结果。

因此，优化Cell Type对于得到好的结果很重要，本文中对于团聚细胞分析，如何调整Cell Type提供了一些指导。

团聚的细胞悬液也是细胞培养条件欠佳的指标，包括但不限于过度消化、环境应激、过度生长和污染。细胞团聚限制了细胞对资源和可用增殖空间的获取。这将阻碍细胞生长，降低通量，并影响下游分析结果，譬如像流式细胞仪分析方法需要单细胞溶液。此外，ISO 20391-1(4)中声明，为了获得最佳计数结果（与所使用的分析方法无关），需要单细胞悬浮液，并且需要正确的样品制备流程。Vi-CELL BLU 细胞计数和活率分析仪用红色框标记（非常）大的细胞团。由于对大细胞团进行计数容易出错，因此这些大细胞团不会进行去团聚处理，并会自动从计数中排除。这些大细胞团的数量可以在结果文件的“Cluster Count”中找到，这是培养物中细胞团聚的良好指标。如果观察到细胞团较多时，建议进一步优化培养条件或进行样品处理。

使用培养 4 天的细胞样品进行初始测量，在Normal模式下使用Mammalian Cell Type重复测量 5 次。然后结果被导出（每 10 张图像照片保存一张）并离线重新分析。为了重新分析，基于默认的Mammalian Cell Type创建了另外两个Cell Type，但将去团聚度设置为Low和High。为了研究不同去团聚度设置的有效性，比较了这三种Cell Type总细胞密度和活细胞密度以及活率的结果。

之后，开始用 HEK 293-F 细胞进行新鲜培养，并在第 0、1、2、3 和 6 天取样。然后，测试了其他采样参数，因为所有日期的样品都用默认的Mammalian Cell Type，以及将Aspiration和Mixing Cycles增加到10次的Cell Type。在所有采样日，将细胞培养液用 5 mL 移液器混合 2 次，然后将 5 mL 细胞培养液转移到 15 mL  Facon管中。接着，用 1000 μL 移液器将样品再混合 3 次，再将 3 x 500 μL 细胞样品转移到 Vi-CELL XR 细胞计数和活率分析仪样品管中，以及将 6 x 200 μL 细胞样品转移到 Vi-CELL BLU 96 孔板中。Vi-CELL XR 细胞计数和活率分析仪上的样品，使用图 1 所示的Cell Type分析；在Vi-CELL BLU细胞计数和活率分析仪上，两种Cell Type交替进行。然后，将 2 x 10 μL 细胞样品与台盼蓝 1:1 混合并转移到一次性血球计数板中手动计数。

图1：Vi-CELL XR上的分析设置，选择的设置类似于Vi-CELL BLU上的设置

然后，在Vi-CELL BLU细胞计数和活率分析仪上运行的样品以High Decluster degree重新分析，在 Vi-CELL BLU 细胞计数和活率分析仪上共生成4种不同的细胞计数结果，以与 Vi-CELL XR细胞计数和活率分析仪的结果和手动计数结果进行比较。

表1. Vi-CELL BLU分析HEK 293-F的Cell Type，Mammalian Cell Type作为其他3个Cell Types的模板。

图2：Vi-CELL BLU使用不同Decluster degree设置分析HEK 293-F的结果。平均总细胞和活细胞密度显示在左轴上，平均活率显示在右轴上。误差线表示标准差。

表 2 中的图像显示了Decluster degree如何影响样品分析，从而影响细胞浓度结果。所选图像是图2中其中一个测量样品的图像（部分），并且很好地表示了细胞样品的状态。如前所述，HEK 293 F细胞倾向于形成团聚体，而这些团聚体中的细胞可能难以计数准确。当 Decluster degree 设置为 low 时，某些团聚将不再被解聚，并且标有蓝色圆圈，表示Vi-CELL软件错误地将它们识别为单个颗粒，因为其尺寸较大，根据所选Cell Type参数未归为一个细胞。通过更高的去团聚度，可以分析更多这些团聚细胞，从而产生单个团聚标记为Normal Decluster degree，所有团聚细胞均在High declustering下进行分析。更高的Decluster degree设置会导致识别出额外的细胞，可能导致人为地提高细胞密度，因为单个细胞可能（几乎）分裂成两个或多个颗粒。这些颗粒是被忽略还是算作活细胞或死细胞取决于其他Cell Type参数，例如大小、圆度和亮度。因此，优化Cell Type设置对于获得准确的结果很重要。

表2. 不同Decluster degree设置的分析结果，随着Declustering增加，更多的细胞团聚被分析，细胞团聚体中更多的细胞被识别。

请注意，Cluster count不受Decluster degree的影响。对于“Low”和“High”设置，每次测量平均计数 1.6 个Clusters。Cluster count指示在样本中发现了多少个过大的细胞团聚体。这些Cluster用红色框标记，并且无论Decluster degree如何，都完全排除在分析之外。因此，高的Cluster count是大细胞团聚体的良好指示，需要在培养处理或样品制备方面进行额外优化，以获得准确的细胞计数结果。

最终，在优化Cell Type设置时，Vi-CELL BLU 软件还提供了增加Aspiration和Mixing cycles的可能性。增加Aspiration和Mixing的影响评估，是使用默认的Mammalian Cell Type，将其中的Aspiration和Mixing cycles都设为10，每天对 HEK 293-F 细胞样品进行采样，并一式三份测定细胞密度。之后，使用表1所述的High Decluster degree重新分析所有测量值。将结果与使用Vi-CELL XR细胞计数和活率分析仪及手动计数获得的值进行比较（图3）。

图3: Vi-CELL BLU用4种不同Cell Types检测的总细胞密度和活率（蓝-灰色），Vi-CELL XR（红色）和手动细胞计数（绿色）。误差线表示标准差。

图 3 显示了 Vi-CELL XR细胞计数和活率分析仪、血球计数板、Vi-CELL BLU 细胞计数和活率分析仪（使用默认Mammalian Cell Type）测试6天得到的细胞密度和活率具有可比性。此外，Mixing增加和/或High declustering的Cell Type会导致更高的细胞密度。在第3天，测量的平均 TCD 介于 2.81 – 4.12 百万个细胞/mL 之间，分别使用默认的 Mammalian 和 Mammalian A10M10  High decluster。因此，与默认设置相比，更改两个参数后结果增加了 47%。

然而，在第6天存活率下降到~70%，而且手动计数的TCD明显比自动细胞计数仪的TCD更高。表 3 中的图像（通过显微镜显示 Neubauer 分析室）为这种偏差提供了清晰地解释，因为与第 3 天相比，第 6 天的细胞样品中显示有更多的细胞聚集体。这些细胞聚集体很难计数，在分析过程中将完全忽略大的团聚细胞。

表3: 第3和第6天HEK 293-F细胞计数显微镜下的照片。第6天可以看到更多的细胞团聚体，细胞活率降低。

专注于培养的前 3 天（图 4）可以进一步研究不同的Cell Type设置如何影响计数结果。第 3 天血球计数板图像（表 3）显示，到目前为止，细胞主要以小聚集体或单细胞形式生长。仔细观察Cluster count可以发现，Clusters的平均数量从第 1 天的 0.7 个增加到第 2 天的 3.7 个和第 3 天的 8.7 个。同时，更高的Mixing和Aspiration cycles的效果似乎有所增加，第 1 天的 TCD 增加了 4%，而第 2 天和第 3 天分别增加了 17% 和 25%。在Mammalian A10M10 High decluster设置下的结果一直是最高浓度。

图4: HEK培养的前3天。在 Vi-CELL BLU 上以蓝灰色以及 Vi-CELL XR（红色）和手动计数（绿色）测定四种不同的细胞密度和活率。误差线表示标准差。

总之，每日采样结果进一步证明了正确Cell Type设置的重要性。仅改变三个参数就导致 TCD 增加 47%。测量团聚的HEK细胞时，调整Decluster degree和Mixing/Aspiration cycles可以得到更高的TCD。然而，第6天的数据（图3）表明，应避免过度团聚的细胞样品，因为与手动计数相比，所有Cell Type的结果都明显较低。

讨论

在处理倾向于形成聚集体的细胞系时，对Decluster degree、Aspiration cycles和Mixing cycles的拟议更改是优化计数性能的良好起点。但是，当可能需要进一步优化时，请随时向贝克曼库尔特生命科学的相关技术人员寻求支持。