派森诺生物与上海海洋大学水产资源开发与利用重点实验室共同合作，在《PLOS ONE》发表论文，首次揭示了草鱼抵抗嗜水气单胞菌感染的免疫应答机制。
1. 研究背景
草鱼（Ctenopharyngodon idella），又名鲩鱼、草鲩、乌青、混子，栖息于平原地区的江河湖泊。嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）广泛分布于自然界的各种水体，是多种水生动物的原发性致病菌。长期以来，草鱼对嗜水气单胞菌较易感，感染个体有较高的死亡率，给渔业资源造成较大的经济损失。嗜水气单胞菌入侵鱼体后，先在肠道内增殖，再经门动脉循环进入肝脏、肾脏及其它组织，引起肝脏、肾脏等器官以及血液病变，继而出现全身症状。那么，嗜水气单胞菌感染草鱼后，草鱼机体的免疫系统是怎样做出应答反应的，基因转录组水平的相关研究还很少。
2. 研究目的
RNA-Seq研究表明多种鱼类如娃娃鱼、青海湖裸鱼、大菱鲆等遭嗜水气单胞菌侵染后，与免疫应答相关的结构和功能基因表达发生了显著变化。为了研究嗜水气单胞菌感染草鱼后，草鱼体内的免疫应答机制，中国海洋大学水产资源开发与利用重点实验室的党云飞等对感染前后不同时间段的草鱼脾脏组织进行了转录组测序。
3. 研究方法
本研究草鱼样本采自江苏吴江国家农场，饲养在用高**钾灭菌的循环水体中，每天饲喂三次。实验组草鱼腹膜内注射100ul 2.7 × 107 CFU/mL嗜水气单胞菌，对照组草鱼注射相同体积的PBS。实验组草鱼注射嗜水气单胞菌后4, 8, 12, 24, 48 和72 h分别取鱼的脾脏组织，并立即用液氮速冻，保存在-80℃冰箱。后续对每个样本分别提取总RNA进行建库测序.
4. 分析内容与结果说明
4.1序列拼接与unigene功能注释
通过RNA-seq无参转录组数据分析，序列拼接共得到52,668 unigenes，平均长度为1,072bp，具体拼接结果见表1。
表1 序列拼接结果
图1 草鱼unigene E-value分布图
4.2 Unigene功能注释
将拼接得到的所有unigenes 与NR数据库比对，并对其进行GO, eggNOG, KEGG功能注释，结果显示unigene主要分布在“cytoplasm” (9,944)，“plasma membrane” (4,144)，“cytosol” (3,726)等功能，具体注释结果见表2，图2.
表2 Unigene注释结果
图2 草鱼unigene GO功能注释（A）和eggNOG功能注释（B）
4.3 草鱼转录本进化保守性分析
为了评估草鱼unigene序列的保守性，用BlastX方法将草鱼序列与其他五种模式鱼（斑马鱼、河豚、棘鱼、青鳉和鲀）数据库进行比较，结果显示有38,910 (73.88%) unigenes共同存在于五种鱼类中，结果见图3.
图3 草鱼unigene保守性分析
4.4 基因表达差异分析
将实验组4, 8, 12, 24, 48 和72 h的测序结果分别与对照组0 h进行基因表达差异分析，6个比较组共得到2,992 DEGs。这些DEGs共参与39个通路，其中参与免疫系统相关通路的有89个DEGs。从图4中可以看出，“complement and coagulation cascades” 补体系统是较多DEGs参与的通路，说明草鱼在遭嗜水气单胞菌感染后，补体成分在免疫应答中发挥着重要作用。
图4 差异基因参与的免疫相关通路
4.5 补体系统相关DEGs qPCR验证
为了进一步验证草鱼在感染嗜水气单胞菌后天然免疫系统相关DEGs的表达量变化，研究者共挑选了18个DEGs进行了qPCR实验，图5是部分qPCR验证结果。结果显示微管蛋白（TUBB）和组织蛋白酶S(CTSS)在感染后4-12 h显著上调；还有一些与补体通路相关的基因如MARCO、CHMP5、MHCI的表达量也出现明显上调，并且与转录组测序的结果一致。
图5 qPCR验证
5. 研究结论
人工养殖条件下的草鱼病害较多，提高草鱼抗病力是增加养殖产量的重要途径之一。由嗜水气单胞菌感染引起的鱼类疾病给渔业生产造成了严重危害，本研究通过第二代高通量测序技术在转录组水平上揭示了草鱼机体抵抗病菌感染的天然免疫应答反应，为进一步研究免疫相关基因之间的网络调控关系提供了有利数据。同时，也为更好的进行草鱼饲养提供了帮助。
6. 原文索引
Dang Y, Xu X, Shen Y, et al. Transcriptome Analysis of the Innate Immunity-Related Complement System in Spleen Tissue of Ctenopharyngodon idella Infected with Aeromonas hydrophila.[J]. Plos One, 2016, 11(7).
转录组文案 马培培