外周血染色体制备

一、试剂准备

1．培养液

2．0.2%肝素溶液

3．0.0005%秋水仙酰胺溶液（黑纸包裹避光置4℃冰箱保存）

4．0.075mol/L氯化钾溶液

5．3:1甲醇、冰醋酸固定液（临用前配制）

6．10%Giemsa染色液

7．2%PHA溶液

二、操作程序

1．标本采集。用肝素润湿的针筒采静脉血1ml，混匀后注入两瓶含5ml培养液的标本瓶中，每瓶0.3～0.5ml。

2．加PHA。每瓶培养液加入PHA溶液0.2ml。

3．培养。标本混匀后置37℃温箱培养72h，每日早晚定时摇匀培养物1次。

4．阻留中期分裂相。于终止培养前2-4h加入秋水仙酰胺，终浓度为0.1µg/ml。

5．收获细胞。将培养物吸至尖底离心管，离心，1000转/min，10min。

6．低渗。吸去上清液，加入预温至37℃的0.075mol/L KCL溶液6～8ml，用吸管吹打混匀后置37℃温箱15min。

7．预固定。加入3:1甲醇、冰醋酸固定液1ml，吹打混匀。

8．离心。1000转/min,10min。

9．固定。吸去上清液，加新鲜配制的3:1甲醇、冰醋酸固定液6～8ml，吹打混匀。

10.离心。1000转/min，10min。

11．重复9、10步骤两遍，使细胞经过3次固定，除第一次固定至少30min外，其余两次固定，每次15min或30min均可。

12．细胞悬液的制备和保存。吸去上清液，加入适量固定液，制成浓度合适的细胞悬液。此液置-20℃冰箱中可保存1至数年。在此期间可随时取出，供各种显带处理或FISH检测之用。

13．制片。用吸管将细胞悬液轻轻打匀后吸取少量，从10cm高处滴至一端倾斜15º的经冰水或20%乙醇浸泡过的洁净无脂的玻片上，每片滴2～3滴，然后在酒精灯上焰上来回通过数次，使其干燥。

14．染色。标本采用10% Giemsa染色液染色20～30min，流水冲洗，待干，镜检。剩余标本置4℃冰箱或-20℃冰箱备做各种显带之用。

三、注意事项

1．培养液的PH以7.3±0.1为佳，偏酸则细胞生长不良，偏碱则细胞固缩。

2．温度应严格控制在37±0.5℃。

3．所有试剂均应采用分析纯产品和三蒸水配制。

4．所有玻璃器皿要求绝对干净，无酸。

5．操作程序1～4需注意无菌技术，严防细菌和病毒污染。