仲春将至，新冠疫情的阴霾却仍在继续，德尔塔(Delta)、奥密克戎(Omicron)这些变异株可谓是一波不平一波又起。而值得庆幸的是，疫苗接种大大抑制了疫情的传播速度，也是由于新冠疫情的爆发，大大加快了mRNA疫苗的发展。
mRNA疫苗相比于传统疫苗具有免疫原性强、安全性高且易研发与生产等优点。伴随着体外mRNA的合成、加工、递送等技术不断地成熟，mRNA疫苗药物商业化生产的步伐在不断加快。mRNA疫苗的生产过程需要经过序列设计、合成、验证，模板线性化、体外转录，纯化，浓缩，LNP包装、纯化，过滤除菌及罐装等步骤。在以上的工艺生产过程中，需要对以下产物进行检测：
1.加帽率;2.加Poly(A)尾产物长度;
3.mRNA序列完整性、序列准确性;
4.纯度、副反应产物;
5.残留DNA;
6.蛋白残留、无菌、内毒素等;
针对mRNA疫苗的研发及生产，国家药监局药审中心在2020年8月发布了《新型冠状病毒预防用疫苗研发技术指导原则(试行)》等5个指导原则的通告，其中对mRNA疫苗的生产工艺、质量特性、质量标准等进行了明确的说明。而对以上产物的检测采用的方法包括质谱法、ELISA、毛细管电泳、一代或二代测序等，其优劣势如下：
可以看到目前常规的检测方法仅仅只能检测其中某一项，为了尽可能同时检测多个mRNA质量相关指标，安升达推出mRNA序列表征新方法，即利用Pacbio三代测序技术，同时检测mRNA序列长度、序列准确性及完整性、PolyA尾长度等指标，对mRNA的序列特征、纯度、产品相关杂质等质量特性进行准确质控，为mRNA疫苗安全性提供有效保证。
为了验证技术流程的准确性，我们合成了不同PolyA长度(10-120nt)的RNA标准品进行测序分析，结果如下图所示，随着长度增加，polyA长度均呈现正态分布，仍保持高准确性。
图1 利用合成的不同长度polyA标准品进行方法学验证
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下机后的原始数据进行数据质量评估及数据过滤;
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质控后的CCS序列与mRNA序列进行比对分析;
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基于序列比对结果，进行mRNA测序深度及覆盖度分析，以评估序列完整性;
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根据序列比对结果，进行序列特征分析，包括PolyA长度统计及RNA序列长度统计。
图2 生信分析流程图
基于以上分析内容，可以获得mRNA的序列完整性、PloyA长度以及mRNA序列长度信息，结果如下：
(1)基于测序比对结果，统计mRNA长度，评估mRNA完整性
图3 mRNA序列长度统计
(2)基于测序比对结果，统计mRNAPolyA长度分布
图4 mRNA polyA长度统计
(3)基于测序比对结果，统计覆盖度、测序深度和序列变异度，评估mRNA的序列完整性和准确性
图5 mRNA完整性及准确性分析
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准确检测mRNA polyA尾长度分布，无偏好性
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mRNA polyA长度检测结果与质谱结果一致性高
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同时检测mRNA polyA尾长度、序列完整性和准确性等多项指标
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关于安升达高通量测序
安升达配备有完整的一代、二代和三代测序平台，可为客户提供多种测序读长、通量和时间周期选择，满足生命科学研究用户对成本和速度的差异化需求。通过自主研发和合作开发，在全长转录组、全长16S分析及基因组学分析等方面形成了独特的技术优势。凭借持续的研发创新，全球化的运营管理和先进的设备平台，为科研人员在基因组学研究、精准医疗与其它应用领域的研究提供最全面的基因组学解决方案。
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