云序生物针对环状DNA特异性的junction位点，采用了outward-facing引物设计策略，示意图举例如下：针对线性DNA，primer 1和primer 2是尾对尾，无法有效扩增；而如果线性DNA的1和3首尾相连形成了闭合的环状DNA， primer 1和2就可以扩增出针对特异性junction位点的产物，从而特异性的检测环状DNA

。​

线性DNA引物设计(尾对尾）                      环状DNA引物设计(首尾相连)

具体操作步骤

具体步骤主要分为三步，分别是碱基序列的获取、转换以及引物的设计。以染色体坐标为chr1：100,021,994-100,023,255的eccDNA为例，进行碱基序列的获取及引物设计。

一、获取碱基序列

1、打开UCSC genome browser 网站，点开Genomes栏，选择测序参考的基因组，如hg19。

UCSC genome browser 网站：http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway

图 1

2.选好基因组版本后，输入eccDNA 的位置坐标“chr1：100,021,994-100,023,255”，点 “GO”（注意：坐标的格式及符号需按模板要求）。

图 2

3. 进入如上图2 中chr1：100,021,994-100,023,255坐标序列的界面后，键盘按“ V+D”键，即可跳出如下图3的新界面（注：有时候按V+D键不一定立马弹跳出界面，需多次尝试）；在跳出的新界面中点击“get DNA”，即可跳出对应坐标的eccDNA碱基序列信息（如图4所示）。

图 3

图 4

二、序列转换

1. 按以上步骤获取的序列为eccDNA对应的线性DNA序列，将首尾相连即为eccDNA的环状序列。将eccDNA序列的5’端300bp左右的序列用绿色高亮标记，3’端300bp左右的序列用黄色高亮标记，以chr1：100,021,994-100,023,255为例，TA为eccDNA的junction位点。

2. 将eccDNA全长序列的3’端300bp序列移至5’端300bp序列上游，得到如下序列：

3. 针对步骤5中的600bp序列设计对应的PCR引物，设计方法同常规引物设计即可，但forward和reverse两条引物需要分别位于蓝色区域和黄色区域（即TA的上游和下游），以确保扩增产物中包含eccDNA的junction 位点。

注：如eccDNA全长小于600bp，则可将300bp相应缩短，只需保证最终扩增产物中含有junction 位点，确定其成环状态即可。

三、设计引物

以primer5.0软件为例

1、打开 primer 5.0 软件，点击“File/New/DNA sequence“，如下图所示：

2、将上列转换后的600bp序列复制到软件中，如下图：

3、点击Primer按钮进行引物设计：

4、点击 search按钮，在弹出的以下对话框中修改引物参数：

5、填写以上参数后，点击OK按钮，程序会弹出引物Search结果(如下图)，点击OK，会弹出可选引物评分：

6、引物筛选：对软件给出的引物根据系统评分从高到低进行筛选。选取对应eccDNA评分最高的引物进行评估，如下图所示：

7、引物评估：使“Sense”中的“Tm”与“Anti-Sense”中的“Tm”差值的绝对值不大于2.5，“GC%”=40%~70%；核对“Hairpin”，“Dimer”，“False Priming”，“Cross Dimer”，调整后结果如下图所示：

8、点击“Edit”/“Copy”，输出“Sense primer”及“Anti-sense primer”，即得引物序列信息。