肿瘤免疫微环境(TIME)的异质性，是影响肿瘤转移、复发和耐药的主要因素，不同的TIME亚型与肝癌的临床相关性尚不清楚。本研究对124名肝癌患者和8只肝癌小鼠的189个样本进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq)。通过分析超过100万个细胞，作者将PCL患者分为五种TIME亚型：免疫激活型、髓细胞或基质细胞介导的免疫抑制型、免疫排斥型和免疫滞留型。不同的TIME亚型具有特殊的空间分布特征，趋化因子网络和基因组特征。此外，在髓细胞亚型中富集的肿瘤相关中性粒细胞(TAN)群体与不良预后相关。通过体外诱导TANs和体外分析患者TANs，作者发现CCL4+ TANs可以招募巨噬细胞，PD-L1+ TANs可以抑制T细胞的细胞毒性，且在人类中性粒细胞亚群中具有相似的特征。小鼠模型体内中性粒细胞耗竭可减弱肿瘤进展，证实了TANs的促肿瘤表型。通过详细分析肝癌细胞异质性，阐明了不同TIME亚型的特征，强调了TANs的免疫抑制功能，并揭示了针对TANs的潜在免疫疗法。

单细胞转录组测序（scRNA-seq），全外显子组测序(WES)，ATAC-seq(染色质可及性分析)

1. 肝癌的大规模单细胞图谱

为研究原发性肝癌（PCL）的TIME，作者对124例未接受治疗的患者的160个样本进行了scRNA-seq分析，其中包括79例HCC, 25例ICC和7例CHC(图1a)。获得了1,092,172个细胞中，鉴定出89个TIME细胞簇(图1b,c)。TIME细胞簇表现出明显的组织和癌症类型特异性。拷贝数分析显示，大多数上皮细胞为肿瘤细胞，具有患者特异性。

2. 细胞模块分析揭示了5种TIME亚型

为了研究PLC的TIME亚型，作者检测了肿瘤组织细胞的共富集模式。层次聚类识别出5个稳定的细胞模块(CM1-CM5)(图2a)，作者将患者分为5个相应的TIME亚型(图2b-e)，并从以下4个方面对每个亚型做了具体分析:(1)细胞组成，(2)功能标记基因表达，(3)时间相关基因特征，(4)预后相关性。

CM1中含有活化的骨髓细胞和T细胞簇，CM1优势患者表现出免疫激活状态，因此被指定为TIME-IA(免疫激活)。CM2中与免疫抑制富集的“骨髓细胞免疫抑制”和“促肿瘤细胞因子”特征有关，并且与较差的预后相关，被指定为TIME-ISM(免疫抑制髓系)。基质细胞均在CM3和CM4中富集。CM3中高表达肿瘤激活的基质基因，预后较差，指定为TIME-ISS(免疫抑制基质)。而CM4含有大量内皮和间充质细胞，缺乏免疫细胞，被命名为免疫排斥表型(TIME-IE)。CM5含有肝驻留细胞簇，包括驻留型自然杀伤细胞(NK_05_CD160) Kupffer细胞(Mph_01_MARCO)和肝窦内皮细胞(EC_01_CLEC4A)，与较好的预后相关。因此，CM5优势患者被指定为TIME-IR(免疫驻留)。这些TIME亚型表现出不同的趋化因子网络，并与肿瘤细胞的不同体细胞突变和转录组谱相关。

作者将以上分类方案命名为TIMELASER，用于区分肿瘤免疫微环境亚型。将这种分类方法应用于空间转录组数据和已发表的scRNA-seq、bulk RNA-seq数据集，均能得到与本文相似的TIME亚型。这些结果验证了本文提出的TIMELASER分类法，并进一步证明该分类法在空间分辨率和bulkRNA数据分析上的有效性。

3. 肝癌中性粒细胞异质性

由于中性粒细胞比较脆弱，基因含量少，单细胞测序中难以捕获，而TIME-ISM（CM2）中多种中性粒细胞亚群的富集、与不良预后的关联促使作者进一步研究中性粒细胞。34,307个中性粒细胞被分为11个亚群，这些亚群表现出明确的组织分离和癌症类型偏好，主要可分为外周血中性粒细胞(PBNs)、邻近肝脏中性粒细胞(ALNs)、肿瘤中富集的中性粒细胞（TANs）。拟时序分析揭示了中性粒细胞从PBN到ALN再到TAN的明确分化路径(图3a)。

值得注意的是，TIME-ISM中三个TAN亚群的组合比例较高(Neu_09/10/11，平均占总TAN的86.8%)，与较差的预后相关，暗示这些TAN具有促肿瘤功能。作者重点关注了两个TANs亚群Neu_11_CCL4和Neu_09_IFIT1的表型和功能。通过mIHC证实，CCL4+ TANs (Neu_11_CCL4)高表达趋化因子相关基因CCL3和CCL4(图3d)。一系列体外实验证实TANs具有趋化因子分泌功能，支持CCL4+ TANs可以招募巨噬细胞的观点。作者还发现，与非TANs相比，TANs中CD274(编码PD-L1)的表达显著增加，其中Neu_09_IFIT1的表达量最高(图3i)。为了研究高PD-L1表达的TANs是否会直接抑制T细胞活性，作者将CD8+ T细胞与体外诱导的TANs或患者衍生的TANs共培养。与体外诱导的TANs共培养的CD8+ T细胞中，T细胞细胞毒性标记物IFNγ和活化标记物CD25和CD69的蛋白水平降低(图3n)。在加入抗PD-L1抗体后， IFNγ的下降被逆转(图3o)，证实PD-L1介导了TANs的抑制功能。

4. 人类和小鼠肝癌中的保守中性粒细胞亚群

为了进一步研究TANs的异质性，作者建立了两种新的自发性肝癌小鼠模型，pTMC小鼠主要发展为HCC, pTMK小鼠主要发展为ICC。作者对来自6只小鼠的21个样本进行了scRNA-seq分析，包括外周血、肿瘤邻近肝脏和肿瘤。17,780个中性粒细胞被分为12个簇，显示出明确的组织特异性和有序的发育轨迹(图4a、b)。TIME-ISM (hNeu_09/10/11)中的三个TAN子集分别对应于mNeu_10/11/12。Cd274在小鼠TANs高表达，与人类TANs一致(图4d)。通过无偏倚的整合跨物种数据，分析关键特征基因，作者发现小鼠和人的中性粒细胞在很大程度上保守(图4c)，这一发现为在小鼠模型中研究中性粒细胞为基础的治疗奠定了基础。

5. 中性粒细胞耗竭延缓肿瘤生长

由于TIME-ISM TANs的促肿瘤表型(Neu_09/10/11)，作者进一步探究了在体内消除这些促肿瘤TANs亚群的治疗效果。使用抗ly6g抗体消耗中性粒细胞后，患癌小鼠的肝癌结节和肿瘤重量显著减少(图4e,f)。与同型对照相比，抗ly6g处理后的TANs数量和TANs的PD-L1表达均下降(图4)。此外，作者观察到浸润性巨噬细胞减少46.6%。虽然Ly6G阻断并没有改变CD8+ T细胞的数量，但它们的衰竭状态得到了缓解。总的来说，中性粒细胞耗竭可以减弱巨噬细胞募集和T细胞抑制，从而抑制肿瘤生长。

本研究通过大规模，免分选的单细胞分析全面描绘了PLC的细胞图谱，识别到五种TIME亚型，解析了中性粒细胞异质性。TIMELASER框架涵盖了大多数细胞群，可对TIME亚型无偏分类。作者推测，对这些数据的深入分析，将为肿瘤- TIME和TIME-TIME串扰提供新的见解，有助于识别免疫细胞功能，指导我们去发现PCL的生物标志物或免疫治疗靶点。本文深入研究了中性粒细胞的异质性及其功能，确定了人类和小鼠之间广泛保守的中性粒细胞谱。TANs具有促肿瘤作用，作者推测CCL4+、SPP1+和PD-L1+ TANs是有希望的免疫治疗靶点。进一步探索中性粒细胞对免疫治疗的影响及其相关的临床混杂因素，将为更好地了解TAN生物学特性，提出肝癌治疗的转化研究途径提供新的机会。

参考文献：

[1] Xue R, Zhang Q, Cao Q, et al (2022) Liver tumour immune microenvironment subtypes and neutrophil heterogeneity. Nature 612:141–147. https://doi.org/10.1038/s41586-022-05400-x