神奇的外泌体


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外泌体概述

外泌体是一种细胞分泌的微小膜泡，大小为30~150nm的磷脂双分子结构，可在细胞间传递物质和信号。它在机体内广泛存在，如外周血、腹水、尿液、唾液、脑脊液等各种体液中。

外泌体携带有多种蛋白质、脂类、DNA和RNA等重要信息，不仅在细胞与细胞间的物质和信息传递中起重要作用，更有望成为多种疾病的早期诊断标志物。

但外泌体所存在的体液环境复杂，在尺寸、形态和生化特性等方面又存在着较大的差异，因此如何能有效地分离出外泌体以供进一步研究一直是该领域的难题。

本篇跟大家简单介绍一下，外泌体提取与纯化过程中常用到的一些方法，以及各种方法的特点。

六大提取与纯化法

1、差速离心法

差速离心法是最常见的外泌体分离技术之一。这种方法利用外泌体与其他细胞器的沉降系数不同，将细胞、细胞碎片以及其他细胞器等，通过不同离心速度分离出去，从而得到纯净的外泌体。

优点：提取方法简单，提取过程中不会引入其他的标记物，适合大剂量的样品处理。

缺点：操作繁琐，费时费力，操作过程中需要超高速离心，且由于离心力的因素，可能会导致外泌体结构破坏从而对下游实验造成影响，对于一些具有高粘度的生物样品（例如血浆和血清样本），则需要更长的超速离心步骤和更高的离心速度。

2、密度梯度离心法

该方法将超速离心与蔗糖密度梯度相结合，利用外泌体1.13g/ml-1.21g/ml的密度范围，实现外泌体与非囊泡颗粒（如蛋白质、蛋白质/RNA聚集体等）进行分离，从而能够提取含量低的外泌体。

2018年Li K等人改良了此方案，使用碘克沙醇作为新的一种高效介质，外泌体回收率更高、纯度更高，并且结构和功能保持更好。

3、聚合物沉降法

这种方法是通过高分子的疏水聚合物（如聚乙二醇（PEG））可以改变外泌体溶解性和分散性的特点，使其能够在比较低的离心力下沉降出来。其原理可能与疏水聚合物竞争性结合游离水分子以及疏水聚合物本身形成的网状结构有关。

优点：操作起来较为简单，不需要超速离心机，得到的外泌体数量较多，对外泌体理化性质影响较小。

缺点：基于聚合物的沉淀方法可能会同时分离非囊泡污染物（如脂蛋白等），从而对下游分析造成一定影响。

4、超滤法

这种方法是将溶剂及小分子物质过滤到膜的另一侧，而将相对大分子物质截留在超滤膜上，以达到分离的目的。外泌体直径范围30～150 nm，利用超滤膜经过长时间的低速离心就可以分离样本中的外泌体。

优点：操作方便，富集效率比较高，易于搭配其他膜或操作，并且成本较低。

缺点：过膜易损耗变形，导致膜堵塞，纯度较低，大颗粒蛋白污染严重，并且在洗脱过程中，附着于膜上的外泌体难以回收，导致提取损失。

5、磁珠特异性捕获法

磁珠特异性捕获法外泌体表面带有许多特殊的膜蛋白，如CD9、CD63、CD81等，可将这些外泌体标志蛋白作为分离外泌体的特异性标记。通过将抗体固定于磁珠等基质上，利用抗体与这些标志蛋白之间的特异性相互作用，从而得以实现对外泌体的特异性富集。

优点：获得的外泌体纯度较高，并且外泌体膜结构不受太大影响。最近的一项研究已应用免疫亲和超顺磁性纳米粒子（ISPN）来结合外泌体，研究人员通过连接抗CD63抗体和纳米粒子生成ISPN，并用它们从体液中分离外泌体。

6、尺寸排阻色谱法

这种方法利用多孔的凝胶球，通过分子大小不同将外泌体纯化出来。在分离提取过程中，大分子物质不能进入凝胶孔，很快沿多孔凝胶间的缝隙被流动相洗脱出来，而小分子物质能进入凝胶孔，滞留时间更长，会更慢地被洗脱出来。外泌体的分子粒径大于一般的蛋白分子，所以外泌体会先被洗脱下来，而粒径小的蛋白质会被后洗脱下来，从而分离出高纯度的外泌体。

优点：获得的外泌体纯度相对较高，且外泌体结构不易受到破坏。