代谢功能障碍和慢性神经炎症是包括多种神经退行性疾病的共同特征。其中，晚发性 阿尔兹海默症（AD）最强的遗传风险因素载脂蛋白 E（APOE） 的E4等位基因与代谢功能障碍和增强的促炎症反应有关。淀粉样蛋白斑块触发附近小胶质细胞的转录变化，导致向病理特征转变。这些重要的研究共同强调了APOE、衰老和大脑区域在代谢和免疫变化中的淀粉样蛋白依赖性和独立性作用。2023年3月，来自University of Kentucky研究团队在 Cell Reports （IF 10.99）上发表题为“APOE modulates microglial immunometabolism in response to age, amyloid pathology, and inflammatory challenge”的研究文章。该研究结合单细胞和空间多组学技术，系统地描述APOE4在大脑对衰老、外周炎症挑战和淀粉样蛋白病理学的反应中的作用（有氧糖酵解增加和脂质代谢途径的表达改变），为后续的研究提供更加坚实的理论基础。
研究材料
样本选择：APOE3（野生型）、APOE4（突变型）和5XFAD（杂交模型）小鼠的大脑组织
取样时间/分组：不同时间点（3、12 和 24 个月龄）、脂多糖处理 (LPS)和淀粉样蛋白过表达的小鼠（n=3~5）
技术路线
步骤1：单细胞多组学揭示APOE4对阿尔兹海默症的影响；
步骤2：单细胞多组学联合揭示LPS刺激下的小胶质细胞代谢特征；
步骤3：空间转录组学揭示APOE4 加剧小胶质细胞活化和脂质代谢功能激活;
步骤4：空间代谢组证实APOE、衰老和淀粉样蛋白对多种脂质代谢途径表达的显着影响。
研究结果
1. 单细胞多组学揭示APOE4 驱动神经胶质转录组的免疫代谢变化
通过常规转录组检测APOE对AD小鼠的整个生命周期的影响，在AOPE4和AOPE3大脑之间发现了数百个差异表达基因（DEG），包括Serpina3n等。接下来，进一步对DEG进行了通路分析，发现TOP 十富集的通路中有9个属于代谢或免疫相关的途径。为了确定细胞特异性对这些基因表达变化的贡献，对大脑组织进行了单细胞转录组检测，结果共鉴定出了13种细胞类型。而通过对细胞群的DEG分析发现星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞和小胶质细胞是受APOE影响最大的细胞类型。然后，对所有细胞的DEG进行通路分析再次突出了代谢的重要作用，尤其是氧化磷酸化和糖酵解相关通路。这些结果表明APOE4主要驱动的是神经胶质细胞的代谢和免疫反应。
图1 APOE4驱动神经胶质转录组的免疫代谢变化
2. 单细胞多组学揭示DAM样小胶质细胞在AOPE4老年脑中增加
淀粉样斑块触发附近小胶质细胞的转录变化，并且诱导其向病理特征的转变，这些发生病理特征转变的小胶质细胞被称为疾病相关小胶质细胞(DAMs)。通过对单细胞数据的进一步分析，发现在高龄和AOPE4小鼠脑中都被上调的基因大量富集了DAM。此外，AOPE4小鼠中小胶质细胞转录组中的特异性变化与之前研究报道的结果相似。观察到许多AD相关基因的表达模式相反，与E3相比，年轻的AOPE4小胶质细胞表达更高。通过对所有星形胶质细胞和小胶质细胞的亚群再聚类分析，发现一个小胶质细胞的Mi_6亚群中APOE上调，其定义Mi_6亚群特征的marker基因几乎完全是与DAM特征相关的基因，包括代谢基因Lpl、Ch25h、Fabp5和APOE本身。以及Mi_6小胶质细胞的通路分析显著表现在胆固醇代谢和糖酵解代谢相关的信号通路。进一步的SCENIC分析发现了Mi_6亚群中16个特异性的转录因子。有趣的是，这些转录因子中有几个先前的报道与AD有关。特别是HIF1α，在Mi_6中大幅上调，并与细胞的DAM评分呈正相关。总之，这些数据表明，即使没有明显的AD病理学，衰老和AOPE4也足以驱动小胶质细胞发生变化。
淀粉样斑块触发附近小胶质细胞的转录变化，并且诱导其向病理特征的转变，这些发生病理特征转变的小胶质细胞被称为疾病相关小胶质细胞(DAMs)。通过对单细胞数据的进一步分析，发现在高龄和AOPE4小鼠脑中都被上调的基因大量富集了DAM。此外，AOPE4小鼠中小胶质细胞转录组中的特异性变化与之前研究报道的结果相似。观察到许多AD相关基因的表达模式相反，与E3相比，年轻的AOPE4小胶质细胞表达更高。通过对所有星形胶质细胞和小胶质细胞的亚群再聚类分析，发现一个小胶质细胞的Mi_6亚群中APOE上调，其定义Mi_6亚群特征的marker基因几乎完全是与DAM特征相关的基因，包括代谢基因Lpl、Ch25h、Fabp5和APOE本身。以及Mi_6小胶质细胞的通路分析显著表现在胆固醇代谢和糖酵解代谢相关的信号通路。进一步的SCENIC分析发现了Mi_6亚群中16个特异性的转录因子。有趣的是，这些转录因子中有几个先前的报道与AD有关。特别是HIF1α，在Mi_6中大幅上调，并与细胞的DAM评分呈正相关。总之，这些数据表明，即使没有明显的AD病理学，衰老和AOPE4也足以驱动小胶质细胞发生变化。
图2 衰老和 APOE4与DAM样小胶质细胞的增加有关
3. 单细胞多组学探究炎症促进APOE4小胶质细胞的代谢功能激活
鉴于AOPE4小胶质细胞表现出的代谢和DAM样特征，接下来研究AOPE4的小胶质细胞是否会对炎症挑战做出不同的反应。通过外周注射LPS和生理盐水，24 小时后，作者从AOPE3和AOPE4小鼠中收取大脑组织，分选后对小胶质细胞群进行单细胞转录组检测。在单细胞数据分析的结果中显示，LPS处理组中，小胶质细胞产生了几个不同的亚群，包括两个富含AOPE3 LPS大脑的亚群（5 和 7）和两个几乎完全存在于AOPE4 LPS大脑中的亚群（8 和11）。其中，富含AOPE4 LPS的亚群表达的DEG富集分析结果显示与线粒体功能、有氧呼吸和能量产生功能相关。并且，这些细胞亚群还显示出与氧化磷酸化和糖酵解途径相关的基因高表达。以上的数据表明，AOPE4的小胶质细胞中炎症刺激下产生强烈的代谢应激反应。
图3 APOE4小胶质细胞在应对炎症挑战时代谢不同
接下来，作者使用靶向代谢组学方法，确定了五种在 AOPE4小胶质细胞中显着上调的代谢物和一种显着下调的代谢物。为了确定这些代谢物的差异是否是 AOPE4小胶质细胞代谢动态变化的一部分，接下来使用稳定同位素分辨代谢组学技术。在存在13C葡萄糖的情况下，用 IFNg和TNF-α的组合刺激AOPE3和AOPE4小胶质细胞，并测量下游代谢物中13C 的掺入。结果表明，在APOE4和促炎环境中，标记的(m+3) 13C乳酸显着增加，表明通过有氧糖酵解途径增强。为了进一步从功能上评估APOE对小胶质细胞代谢的影响，使用Seahorse平台来测量糖酵解、线粒体呼吸等多个途径对 ATP产生的相对贡献。AOPE4小胶质细胞主要是通过增加糖酵解生成ATP来响应促炎刺激。另外，HIF1α TF复合物易位至细胞核并激活许多对增加糖酵解很重要的基因，HIF1α的这种表现与AOPE4模型小胶质细胞的表型一致。接下来，作者对这些分析结果数据通过RT-PCR进行了验证。综上所述，这些数据共同突出了功能性代谢重编程，AOPE4小胶质细胞表现的是经典活化的巨噬细胞的表型，具有促糖酵解和抗氧化的作用。
图4 AOPE4 小胶质细胞增加了有氧糖酵解和更高的 Hif1a 表达
4. 空间转录组学研究显示APOE4加剧小胶质细胞的活化和脂质代谢
接下来，利用10x visium空间转录组技术研究了AOPE3、AOPE4以及与5XFAD杂交的小鼠在年轻和年老时冠状脑切片的表达情况。对这些数据进行分析共鉴定出了18个clusters，并且发现只有一个cluster（cluster11）特异性存在于AOPE4/5XFAD杂交小鼠的大脑皮质区。通过进一步分析发现，这一特殊的cluster显著富集脂质代谢、突触修剪、神经元死亡以及小胶质细胞激活相关的基因。将这些数据与单细胞转录组测序的数据进行联合分析，结果表明，这一特征仅在小胶质细胞中表达，尤其是Mi_6亚群的表达尤为显著。为了确定这种独特的AOPE4/5XFAD转录谱是否在空间上与AD病理相关，我们对空间转录组相邻10μm的位置取了切片用于染色，充分验证了空间转录组数据分析的结果。然后，作者基WGCNA分析突出显示了斑块强度与包含与离子通道和突触传递相关的基因的两个基因网络呈负相关。然后将结果映射到单细胞转录组数据上，作者发现了一个被称为 “小胶质细胞激活模块”的洋红色调控网络被映射到小胶质细胞上，而红色的“脂质、少突胶质细胞反应性”模块主要映射到少突胶质细胞。有趣的是，红色和洋红色模块在APOE4/5XFAD小鼠进行的空间转录组数据中确定的少突胶质细胞基因（OLIG）和plaque-induced gene (PIG) 网络实质上重叠。并且PIG 评分在年轻大脑中最低，随着年龄的增长略有增加，在APOE4/5XFAD大脑中最高，而OLIG评分遵循相反的趋势。总之，这些数据突出了APOE4小胶质细胞活化增强以及脂蛋白和脂质代谢的改变。
图5 APOE4加剧小胶质细胞活化和脂质代谢的改变
5. 空间代谢组学证实APOE、衰老和淀粉样蛋白对多种脂质代谢途径表达的显着影响
在上述的脑组织空间转录组研究中，作者注意到 APOE、衰老及其相互作用对多种脂质代谢途径有显著影响。为了验证涉及脂质失调的特征，作者通过空间代谢组学技术（MALDI-MSI）来对目标脂质种类进行空间分辨的定性和定量检测，并且只在APOE4/5XFAD小鼠脑中发现与疾病相关的病理区域。与其他组相比，APOE4/5XFAD脑组织中多种脂质种类的含量发生了变化，包括多种磷脂酰胆碱（PC）。APOE4/5XFAD大脑中磷脂酰胆碱增加最多的PC(16:0/18:2)在皮质、海马体和丘脑中显示出巨大变化，但在梨状区、皮质底板和下丘脑中没有差异。综上所述，这些结果表明，APOE4/5XFAD脑脂质代谢失调的转录特征通过多种脂质(特别是PC)的改变得到了验证。
图6 多种脂质种类的区域特异性变化
小编小结
在这篇研究中，作者着手时下热点技术，采用单细胞和空间多组学方法系统地研究 APOE基因型对衰老、炎症挑战和淀粉样蛋白反应的影响。首先，应用单细胞多组学技术揭示了小胶质细胞(Mi_6)亚群在APOE4和衰老的AD模型组中的重要作用，详细的描述了APOE4小胶质细胞通过糖酵解等调控途径促进炎症，从而形成有利于慢性神经炎症的情况。其次，作者基于空间转录组学技术揭示了APOE4脑中看到的PIGhigh/OLIGlow可能导致补体激活，突触修剪异常以及轴突髓鞘形成失衡，从而进入恶性循环，传播神经炎症和脂质循环受损。最后，作者利用空间代谢组学技术还发现了在APOE4中存在一个与脂质代谢相关的特征区域。总的来说，通过单细胞和空间多组学技术揭示了APOE4通过以代谢途径为中心使易感脑区更易发生神经变性的调控机制，并提出了结合代谢和炎症的治疗方法可能在治疗和预防AD方面具有极大的应用前景。
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