1,用特殊的微孔板作为测定板,用亲和素包被微孔板,然后用生物素标记探针的3端,再通过该生物素和包被在微孔板上的亲和素发生连接,将探针固定在微孔板上,形成一个固相捕获系统.注意:探针5端和待检靶序列5端的一段要互补.
2,在扩增时,引物用抗原(生物素,地高辛或荧光素酶等)标记,这样扩增产物中就会渗入抗原.
3,PCR扩增产物与微孔板上的探针杂交,从而捕获被测靶序列,由于扩增产物中已经渗入抗原,在微孔中加入HRP标记抗体后,酶标抗体就与靶序列的抗原免疫结合,最后加入酶底物进行酶促显色,通过光密度测定实现精确定量.
PCR-ELISA比PCR本身在病毒分型,基因多态性分析与克隆鉴定等方面有其独特的优势.另外,不应用同位素标记,因而避免了放射性带来的危害,而且整个实验周期仅需6h左右,较Southern blot杂交大为缩短实验时间,操作简便,可用于大量标本的检测.尽管与荧光素染色凝胶电泳相比较,PCR-ELISA检测结果的特异性,灵敏性和准确性有显著的提高,但是ELISA基本上是一个开放性的反应系统,特别是在洗涤ELISA反应板时,很容易造成污染,从而引起假阳性.因此,在PCR-ELISA整个实验过程中,必须进行严格的无菌操作.同是,PCR-ELISA对PCR产物和探针的杂交条件(PCR产物的稀释度,杂交温度和时间)要求严格.
免疫酶技术和其他技术进行综合和交叉,是这个发展过程的明显特点.值得注意的是,电子计算机科学技术,分子生物学,物理学,化学,材料科学和数学等科学技术的发展都将影响免疫酶技术的发展.今后,免疫酶技术很有可能和电子计算机科学技术,生物体数量基因调控的深入提示以及物理化学特殊新型材料形成新渗透和综合,使人类对生物科学的研究以及对病原体,细菌与病毒及相关产物的检测和研究达到前所未有的深度和高度.
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