免疫组化的介绍
免疫组化---概念
免疫组织化学
免疫组化是利用抗原与抗体特异性
结合的原理，通过化学反应使标记抗体
的显色剂 (荧光素、酶、金属离子
、同位素) 显色来确定组织细胞内抗
原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、
定性及定量的研究，称为免疫组织化
学。
免疫组化---分类
根据标记物不同分为：
免疫荧光法
利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。
免疫酶标法
基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。
免疫胶体金法
用胶体金标记抗体作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。
免疫铁蛋白法
以铁蛋白标记抗体，铁蛋白含有2000―3000个铁原子的致密铁离子核心，形成四个圆形致密区，所以，具有较高的电子密度，易于电镜观察。
***免疫自显影法
同位素标记
免疫组化---染色方法
即直接法：
标记物（荧光素和酶等）直接标记特异性抗体
（一抗），标记抗体和抗原结合
间接法：
标记物（荧光素和酶等）标记在二抗上，通过一
抗与抗原结合
抗体桥法：
标记三抗，二抗为未标记桥抗体
PAP法（Peroxidase-Antiperoxidase Method 过氧化物酶-抗过氧化物酶）
一抗 + 二抗 + PAP复合物（HRP + 抗HRP抗体[与
一抗统一种属]）+ HRP底物显色
•SP法（Streptavidin-Peroxidase Methed 链霉亲和素-过氧化物酶法）
一抗 + 生物素标记二抗 + HRP标记链霉亲和
素 + HRP底物显色
•ABC法（Avidin-Biotin-peroxidase Complex Method 亲和素-生物素-过氧化物酶复合物）
一抗 + 生物素标记二抗 + ABC复合物（亲和素
- HRP标记生物素）+ HRP底物显色
SABC法 (Streptavidin-Biotin-peroxidase
Complex Methed 链霉亲和素-生物素-过氧化
物酶法)
一抗 + 生物素标记二抗 + SABC复合物（链霉亲和素+ HRP
标记生物素）+ HRP底物显色
免疫组化中常用的组织和细胞标
本
•组织标本
-石蜡切片
-冰冻切片
•细胞标本
-组织印片
-细胞培养片(细胞爬片)
-细胞涂片
样品准备
取材
•*标本新鲜：一般在2h以内进行，超过2h，
组织将有不同程度的自溶，其抗原或变性消
失，或严重弥散。
•*取材部位：除取病灶或含待检抗原部位
外，还应取病灶与正常交界处，即所取组织
切片中同时应有抗原阳性和阴性区，以形成
自身对照。
•-细胞坏死后，不仅抗原弥散或消失，而且
常引起非特异着色，干扰观察，因此取材时
应尽可能避开坏死区。
固定
Ø定义：应用各种方法使组织样本尽量保持其离体前
状态的过程称为固定（fixation）
。
Ø固定的作用：从组织学的角度其简单的定义是，保
持细胞、组织的固有形态和结构，而从免疫组化技
术的角度，固定的作用：是使细胞内蛋白质凝
固，尽量减少或终止外源性酶和内源性酶的反应；
防止细胞的自溶，以免使抗原扩散至组织间质；以
保持组织的固有形态和结构；更重要的是保持组织
或细胞的抗原性，不但要使抗原不导致失活，而且
不使抗原发生弥散的现象，才能在免疫组化染色
时，不产生过深的背景，影响对阳性物的判断
。
Ø组织固定越新鲜越好。组织一经离体，就能及时地
固定，这是最好的。
固定液
对不同类型的组织应适当合理地选择固定液。固定剂的种
类繁多，成份复杂，对组织的作用不尽相同。在科研实验
中，对于组织的固定，应有针对性的选择，方能获得满意
的效果。
较好的固定液应具有强渗透力，能迅速渗入至组织内
部；其次不会使组织发生过度收缩变形，并能使组织内易
观察的成分得以凝固为不溶性物质；还要使组织达到一定
硬度，有较好的折光率。固定液分为简单固定液和混合固
定液
简单固定液
1. 甲醛（formaldehyde）
是无色气体，易溶于水成为甲醛溶液。易挥发，且有
强烈刺激气味，常用得是37％～40％的甲醛溶液，商品名
为福尔马林（formalin）。用作固定的浓度习惯为10％福
尔马林，实际含甲醛4％。
10％福尔马林渗透力强，固定均匀，对组织收缩少。
对脂肪、神经及髓鞘、糖等固定效果好，是最常用的固定
剂。经福尔马林固定时间长的组织，易产生黑色的沉淀，
称福尔马林色素，影响染色效果。
2. 4％中性甲醛固定液：常用的固定液，能满足常规HE及
免疫组化工作。中性甲醛是以 pH 7.2～7.4的***酸缓冲液
为溶剂配制的，其固定效果及对组织抗原性的保存均优
于一般的4％甲醛固定液。
3.乙醇固定液：使用时以80％～95％的浓度为宜，具有硬
化、固定、脱水等作用，对组织渗透力较弱，因此很少单
独使用，
4. 4％ 多聚甲醛
Paraformaldehyde 多聚甲醛 (CH2O)n 易溶于碱性条件
使用PBS配置，可用NaOH 调节PH促溶
多聚甲醛不稳定，存在解聚的 过程，4度 一两周之
内使用完比较好， -20度 一年内不受影响 ，建议现配现
用。
多聚甲醛易溶于脂类物质，因此能穿过细胞膜进入细
胞内。用多聚甲醛固定细胞时，能使细胞内的自由氨基基
团发生化学交联。当不同的分子发生交联时，形成一网状
结构，把细胞的各个结构成分连接起来。
免疫组化常用多聚甲醛和中性缓冲甲醛作为固定液；
混合固定液
•简单固定液只是对细胞的某些成分固定较好，而不
能将所有成分都保存下来。相互配合使用能取长补
短，得到比较好的固定效果。
•乙醇一甲醛(乙醇－福尔马林，AF)固定液：该固
定液有固定兼脱水作用，固定后的标本可直接入
95％乙醇脱水。
•B5(醋酸钠一升*一甲醛)固定液：多用于固定淋巴
组织。染色前应进行脱*沉淀处理。
•Bouin固定液：对组织固定较均匀，收缩很少，不
会使组织变硬变脆。需现配现用。
•Carnoy固定液：穿透能力强，可很好的固定细胞
质和细胞核，特别适合于固定外膜致密的组织，亦
适用于糖原及尼氏小体的固定。
•总之固定液的种类很多，需要根据实验目的来选择
合适的固定液。
