对于具有遗传性疾病的病人而言，人生中收到的最宝贵的礼物应该是许久没有感受过的健康。

   提到基因编辑，相信大家目前最熟悉，也是听到次数最多的，应该是CAS9或者由CAS9所衍生出来的KI之类的基因编辑技术。同时随着FDA批准了其治疗遗传性血管性水肿（HAE）的体内CRISPR疗法NTLA-2002的研究型新药以及最为轰动的英国药品和保健产品监管机构（MHRA）宣告批准由Vertex和CRISPR Therapeutics共同研发的全球首个CRISPR/Cas9基因编辑药物Casgevy附条件上市，曾经获得诺奖的技术再次进入人们的视野。基因编辑的临床应用也开始初露锋芒，但有褒有贬，CAS9虽然表现力不俗，却也依旧有属于他的局限性，特别是基于双链DSB（双链DNA断裂）所带来的非同源重组修复产生的结果相对随机且不可控，虽然缺失了，但是缺口处的序列却可能并不如我们所预期的那样，这可能会带来一些其他无法预料的结果。同年，一篇名为“Base editing of the HBG promoter induces potent fetal hemoglobin expression with no detectable off-target mutations in human HSCs^【1】”的研究论文提出了属于他的解决方法——胞嘧啶碱基编辑器。

图2：胞嘧啶碱基编辑器的原理^【2】

   那么可能有一个问题就产生了，什么是胞嘧啶碱基编辑器？OK，我们先将目光从这篇文章上移开，将注意力放到这一项关注单碱基编辑的技术上。虽然这项技术被称为胞嘧啶碱基编辑器，但他还是脱胎于CAS9，结构上，第一代的BE1由rAPOBEC1(大鼠胞嘧啶脱氨酶)和完全失去切割活性的dCas9组成（rAPOBEC1-XTEN-dCas9），使得一个目标 DNA 碱基以可编程方式直接，不可逆转地转换成另一个，而不需要 dsDNA 骨架切割或供体模板。我们设计了 CRISPR/Cas9和胞苷脱氨酶的融合物，其保留了用指导 RNA 编程的能力，不诱导 dsDNA 断裂，并介导胞苷向尿苷的直接转化，从而影响 C → T (或 G → A)取代。由此产生的“碱基编辑器”在大约五个核苷酸(nt)的窗口内转换胞苷，并能有效地纠正与人类疾病相关的各种点突变。但是在体和体外细胞中的实验差异使研究人员发现一类对该替换方式产生影响的物质——细胞内存在尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)，那么发现了问题就要去解决它，研究人员通过在dCas9后面融合了来自噬菌体PBS的尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(UGI)抑制UDG的活性，并构建出第二代的胞嘧啶碱基编辑器BE2（rAPOBEC1-XTEN-dCas9-UGI）。为了进一步提高编辑效率，David Liu实验室结合细胞的内源修复机制开发了第三代碱基编辑器BE3（rAPOBEC1-XTEN-nCas9-UGI）。

BE3将BE2中的dCas9替换为nCas9(D10A)，可特异性地在非编辑链上产生一个缺口，进而刺激细胞内的碱基错配修复途径(MMR)，以含有U的编辑链作为模板进行修复，从而增加编辑效率。BE3的编辑效率比BE2提高了2~6倍，平均约为37%，该碱基编辑器是目前较为广泛使用的CBE版本，在四种转化的人和鼠细胞系中，融合尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)并使用靶向未编辑链的 Cas9切口酶的第二代和第三代碱基编辑器操纵细胞 DNA 修复反应以有利于所需的碱基编辑结果，导致永久校正总细胞 DNA 的15-75%^【2】

图3：不同胞嘧啶碱基编辑器的编辑效果^【2

   在后续的研究，研究者发现在某些基因座上，诸如 BE3的碱基编辑器产生不希望的副产品，其中目标 C: G 碱基对转换为 G: C 或 A: T 碱基对，而不是所需的 T: A 产物。在这里，研究者阐述了碱基编辑产品纯度的决定因素，并确定了产生不需要的副产品所需的UDG活性。通过分析单个 DNA 测序读数，发现阻断对于单个 C 在编辑窗口内的目标基因座来说，阻断UDG的作用是特别重要的，以最小化不需要的产物。利用这些见解，我们设计了第四代碱基编辑器 BE4 rAPOBEC1-XTEN-nCas9-2UGI (化脓性链球菌 Cas9衍生的碱基编辑器)和 SaBE4(金黄色葡萄球菌 Cas9衍生的 BE4)，与之前描述的包括 BE3在内的碱基编辑器相比，它们以更高的效率进行碱基编辑，并大大提高了产品纯度。最后，研究者开发了另外的碱基编辑器ーーBE3-Gam，SaBE3-Gam，BE4-Gam 和 SaBE4-Gam ーー使用噬菌体 Mu dsDNA (双链 DNA)末端结合蛋白 Gam 来最小化碱基编辑期间不需要的插入缺失的形成，并进一步提高产品纯度，没有明显的活性损失^【3】。

图4：BE4和BE3胞嘧啶碱基编辑器的编辑效果^【3】

图5：GAM-BE4和GAM-BE3胞嘧啶碱基编辑器的编辑效果^【3】

   了解完什么是胞嘧啶单碱基编辑器之后，我们再回到开头的那篇文献，通过破坏抑制性调节结构域重新激活沉默的 γ-珠蛋白表达为治疗 β-血红蛋白病提供了一种治疗策略。在这里，研究者使用胞嘧啶碱基编辑器(tBE) ，破坏转录因子结合基序的造血干细胞。通过用 tBE 进行六个基序的功能筛选，作者发现直接破坏 HBG1/2启动子中的 BCL11A 结合基序触发了最高的 γ-珠蛋白表达。通过使用 Cas9核酸酶或常规 BE (ABE8e 和 hA3A-BE3)与其它临床和临床前策略并行比较，发现 tBE 介导的 HBG1/2启动子处 BCL11A 结合基序的破坏触发了健康和 β-地中海贫血患者造血干/祖细胞中最高的胎儿血红蛋白，同时没有显示可检测的 DNA 或 RNA 脱靶突变。TBE 持续的治疗性编辑持续增殖造血干细胞，表明 tBE 介导的 HBG1/2启动子编辑是治疗 β-血红蛋白病的安全有效的策略。

图6：胞嘧啶碱基编辑器的编辑效果^【1】

    伴随着基因治疗的发展，精准医疗会渐渐成为这种治疗方式的主旋律，减少不必要的突变和不可预测之外的情况的产生更是重中之重，在这个基础上工具载体的选择也就格外重要。吉凯基因拥有丰富的sgRNA设计经验，完善的病毒包装生产体系，严格的质控标准，为广大科研工作者提供可靠的基因调控产品。同时吉凯基因的CRISPR-Cas9系列产品已获得MIT及哈佛大学在专利上的联合授权，欢迎大家咨询订购。