三维（3D）生物打印技术是将生物材料和活细胞组成的生物墨水精确地打印，从而将活细胞封装成精细的结构，已广泛应用于各种应用，包括组织工程、药物筛选和再生医学。3D生物打印需要使用负载细胞的生物墨水进行可靠、准确的打印，但生物墨水储存库中的细胞沉降是导致打印过程不稳定和nozzle堵塞一个重大问题。基于喷墨技术的生物打印虽然具有较高的打印分辨率和生物油墨沉积的良好可控性等优点。但是，它对生物油墨粘度的兼容性有限，只有粘度范围在3-30mPa·s的低粘度生物墨水较为适用，但打印过程中细胞沉降是显著的。

▲ 图1 含活细胞生物墨水喷墨生物打印过程中细胞沉降对打印质量的影响

如图1所示。在喷墨生物打印过程中，生物墨水储存库中的细胞沉积现象及其导致的细胞聚集和打印可靠性差。在生物打印过程开始时，生物墨水使用移液管进行混合，生物墨水储存库内的细胞空间分布相对均匀。随着打印时间的增加，悬浮细胞沉积到生物墨水库底部，底部局部细胞浓度明显增加。为了解决这一现象，徐长学课题组提出了一个物理模型进行研究。

▲ 图2 当选择低细胞浓度进行3D生物喷墨打印时，在沉降过程中单个细胞的受力分析

理论研究对于了解细胞沉降现象的机理很重要。通过在喷墨生物打印过程中对单个细胞进行力分析，系统地研究了细胞沉降机制，一般来说，细胞的沉降过程由四种力决定，包括重力、阻力、浮力和细胞间相互作用产生的力。当选择低细胞浓度的生物墨水进行3D生物打印时，细胞彼此相对远离，细胞间的力交互作用是可以忽略不计的。由于细胞的重力大于细胞的浮力，细胞开始沉淀，阻力开始发挥作用。在稳态平衡状态下，胞体引力与胞体浮力和阻力相平衡，如图2所示。随着打印时间的推移，细胞越来越多地沉积到生物墨水库底部，导致局部细胞浓度显著增加。相邻细胞之间的距离越来越小。当它达到一个临界值时，细胞-细胞相互作用的力开始发挥作用，细胞开始通过细胞间的相互作用相互粘附形成细胞聚集，从而影响喷墨打印过程及结果。

▲ 图3 渗透机制导致的水运输和促进扩散机制导致的离子运输

但是，胞体重力在胞体沉降过程中可能会发生变化，由于细胞膜具有选择性的渗透性，存在水的输运，如图3所示，水通过渗透作用在细胞膜上进出细胞，直到达到平衡。细胞沉降现象的主要特征是通过测量细胞沉降速度和由此引起的细胞浓度变化来表征。细胞沉降速度以μm/s为单位，具体值取决于不同类型的细胞，其质量和生物墨水的组成不同（如聚合物浓度、生物材料等），研究结果如图4所示。

▲ 图4 细胞沉降定量:(a) Ficoll PM400浓度对MCF-7乳腺癌细胞沉降速度的影响;(b)海藻酸钠浓度和打印时间对生物墨水库底部细胞沉降速度和由此产生的细胞浓度的影响

Chahal等人利用了含有MCF-7乳腺癌细胞和不同Ficoll浓度的Ficoll PM400的生物墨水。在没有Ficoll PM400的情况下，平均细胞沉降速度为7.5μm/s，导致严重的细胞沉降和细胞聚集成细胞簇。然而，当Ficoll PM400的浓度分别增加到5%、10%和15%（w/v）时，这个平均速度分别下降到2.3、0.8和−0.15μm/s。这表明，在10-15%（w/v）FicollPM400时达到了中性浮力。Xu等人使用含有NIH 3T3小鼠成纤维细胞和海藻酸钠的生物墨水，系统地定量生物墨水储存库底部的细胞沉降速度和最终的细胞浓度。结果表明，当海藻酸钠浓度从0.5%增加到1.0%（w/v）时，细胞沉降速度从1.45μm/s下降到0.65μm/s。随着打印时间的延长，生物墨库底部局部细胞浓度增加。细胞沉降导致细胞粘附和聚集，显著影响生物打印性能，因此研究者们提出了各种方法来减缓细胞沉降，主要可分为两类：主动搅拌充满细胞的生物墨水和添加功能性生物相容性材料。如图5所示。

▲ 图5 减缓细胞沉降的方法：（a）在喷墨生物打印中使用磁搅拌棒间歇搅拌；（b）)在喷墨生物打印中使用磁力搅拌装置；（c）在喷墨生物打印中添加Ficoll PM400以实现中性浮力；（d）在基于微阀的生物打印中添加PVP大分子；（e）在投影式立体平版印刷中添加SF颗粒以增加生物墨水的粘度

结论

首次专门针对3D生物打印中的细胞沉降现象进行综述，有助于人们更多地关注这一现象及其对打印可靠性和质量的影响。随着打印时间的推移，悬浮细胞沉积到生物墨水库的底部，是3D生物打印中的挑战，直接关系到细胞的粘附和聚集，严重影响3D生物打印的打印性能。徐长学课题组提出的基于物理的模型有助于解决细胞沉积过程中的复杂动力学问题。然而除了生物墨水浓度和粘度外，还有其他参数可能影响细胞沉降和聚集，因此，研究新的有效和高效的缓解方法至关重要。细胞沉积是一个涉及材料科学、机械工程和生物医学工程的多学科课题，应该开发整合这些领域的方法来缓解细胞沉降，以确保打印的可靠性以及使用3D生物打印制造的组织和器官的功能。