脓毒症是由宿主对感染反应失调引起的危及生命的器官功能障碍疾病，占全球报道死亡病例的20%。由于免疫反应失调，常伴随细胞因子风暴、免疫抑制、代谢失调、器官功能衰竭，最终引起死亡，相关临床研究及药物治疗收效甚微，因此急需寻找新的提升患者预后的治疗方法。

嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila，AKK）是一类革兰氏阴性益生菌，在治疗免疫失调和代谢失调中效果显著，然而AKK在脓毒症治疗中的应用及分子机制尚未研究。

问题1：AKK在脓毒症患者中的抗炎症效如何？

问题2：AKK治疗脓毒症的分子机制是什么？

2bRAD-M测序、16S测序、RT-qPCR、流式、WB、RNA-seq（由伯豪生物提供）、IP、ELISA、非靶向代谢组学等。

通过败血症和正常人肠道菌群分析发现，AKK在败血症患者的粪便中显著减少。给盲肠结扎穿刺手术小鼠和LPS诱导败血症小鼠喂食AKK，能显著改善小鼠生存质量，并减少死亡率。代谢组学发现，AKK可产生三肽RKH（精氨酸-赖氨酸-组氨酸），行使抗败血症功能。RNA-seq（伯豪生物提供）等机制实验发现，RKH通过与TLR（Toll样受体）互作，抑制TLR通路激活，降低巨噬细胞产生细胞因子风暴的能力，从而改善败血症患者的生存质量和预后生存。该研究发现了一个新型的三肽RKH，可以抑制TLR活性，有希望成为败血症患者的新型治疗方法。

1. 肠道微生物AKK在小鼠败血症模型中具有保护作用 

通过CLP造模小鼠的粪便微生物基因组测序分析发现，AKK在CLP败血症模型中显著降低（Fig 1a），PCR验证了测序实验结果（Fig 1b）。临床败血症患者的大规模验证中，AKK丰度显著降低（Fig 1c）。将败血症患者分为AKK高和低两组，16S-seq也证实了相同的结果（Fig 1d）。

给CLP造模小鼠接受AKK治疗后，AKK给药丰度高的小鼠生存率显著高于AKK丰度低的小鼠（Fig 1e）。采用CLP手术诱导败血症后，分别给予PBS、活AKK、加热灭活AKK治疗，在活AKK组小鼠生存率远高于PBS和灭活AKK组（Fig 1f），且活AKK组，小鼠肺和肝脏炎症反应显著降低（Fig 1g-h）。接着使用AKK培养基上清治疗CLP败血症小鼠，小鼠的生存率、炎症程度、肺和肝脏的功能均有所恢复（Fig 1i-k）。

接着采用LPS诱导的小鼠败血症模型，也证实了活的AKK治疗及AKK上清均能改善小鼠生存，缓解肺和肝脏损伤（Fig 1l-o）。本次实验证实活的AKK能有效缓解。

2. AKK产生RKH保护小鼠免受致死性败血症损伤

为了进一步探究AKK的保护机制，作者采用非靶向代谢组学对AKK上清和空白培养基进行了主成分分析（Fig 2a）和差异代谢物分析（Fig 2b），发现RKH在AKK上清中差异最明显（Fig 2b-c），且代谢物通路分析也发现RHK代谢通路显著富集（Fig 2d）。靶向代谢组学证实了RKH在AKK上清中显著上升（Fig 2e）。采用无菌鼠定植方法，活AKK定植组的RHK水平显著上升（Fig 2f-g）。在败血症患者粪便中，RKH水平显著降低（Fig 2h）。

接着，作者在CLP造模前先给与小鼠RKH处理，生存分析发现RKH处理小鼠的生存率显著升高（Fig 2i）。小鼠器官（包括肺、肝脏、肾脏和心脏）免疫组化发现，RKH前处理小鼠的炎症水平降低（Fig 2j），血浆丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、肌酸激酶（CK）、肌酸酐和尿素水平降低（Fig 2k）。且小鼠器官（包括肺、肝脏、肾脏和心脏）中的炎症基因表达降低（Fig 2l）。在LPS诱导的败血症模型中也发现了相同现象（Fig 2n-o）。结果证实，AKK产生RKH保护小鼠免受败血症致死性损伤。

3. RKH抑制败血症引起的系统性炎症

作者采用RKH处理后的败血症小鼠腹腔液进行RNA-seq，主成分分析发现RKH处理后，表达谱显著变化（Fig 3a），尤其是炎症相关基因（Fig 3b）。RT-qPCR、ELISA实验证实活AKK处理后，小鼠血浆和腹腔液中细胞因子丰度显著降低（Fig 3c），AKK上清液和RKH处理均呈现相同结果（Fig 3d-e）。

前期研究发现，巨噬细胞激活在败血症早期的细胞因子风暴中发挥了重要作用，通过流式，作者也发现败血症小鼠外周血中的巨噬细胞占比显著升高（Fig 3f），而活AKK治疗活RKH治疗均能显著降低败血症小鼠外周血中的巨噬细胞水平（Fig 3g）。体外实验证实RKH通过抑制促炎因子生成，而非诱导细胞毒性发挥系统性炎症的抑制作用（Fig 3h）。

4. RKH靶向TLR抑制TLR激活

TLR在系统性炎症的发生中发挥着重要作用。作者发现RKH显著降低TLR4信号通路下游蛋白（Fig 4a-b）。RKH显著减少LPS与TLR4的互作（Fig 4c），表面等离子共振分析发现，RKH可以直接结合TLR4（Fig 4d），增强TLR4的抗蛋白酶水解能力（Fig 4e），导致TLR4丰度升高（Fig 4f）。

IP实验发现，RKH可以与LPS竞争性结合TLR4（Fig 4g-h），提示RKH可能抑制TLR4活性。采用分子对接分析发现，RKH可以与TLR4/MD2结合口袋互作（Fig 4i）。突变TLR4的结合口袋后，RKH与TLR4的结合能力显著降低（Fig 4j）。

在TLR4敲除的CLP造模小鼠中，RKH处理与对照相比，小鼠生存率没有显著变化（Fig 4k）。小鼠肺病理变化、血浆炎症因子水平、肺和肝脏功能均有所改善（Fig 4l-o）。这些结果证实，RKH抑制败血症进展，在一定程度上，是通过抑制TLR4通路发挥调节作用。

5. RKH降低败血症仔猪模型的高炎症反应

作者构建了败血症仔猪模型（Fig 5a），并发现RKH治疗可改善仔猪的生存时间（Fig 5b）。仔猪血清中AST、γ-谷氨酰转肽酶和乳酸脱氢酶、尿素、IL-6、IL-1β丰度均显著降低（Fig 5c）。组织病理学也发现仔猪多种器官中的促炎因子表达显著下降（Fig 5d-g）。综上所述，RKH可以降低败血症诱导的死亡率，并改善仔猪模型中的全身炎症和器官损伤。

6. RKH负调控脓毒症患者巨噬细胞的促炎活性

分离败血症患者外周血中的巨噬细胞，LPS刺激后，在RKH处理组IL-6丰度明显降低（Fig 6A）。分离外周血CD4+和CD8+ T细胞（Fig 6b），激活或未激活，RKH处理不改变T细胞凋亡程度（Fig 6c-d），也不改变T细胞分泌细胞因子能力（Fig 6e-f）。这些结果证实，RKH通过负调控巨噬细胞的促炎活性，改善败血症患者的身体状况，而非影响T细胞的功能。

文章提供了败血症发展过程中宿主-微生物组相互作用的新证据。通过揭示活AKK产生的一种新的生物活性三肽RKH，解析了活AKK的病理生理作用。对处于高炎症状态的患者，RKH可能是致命败血症的潜在有效治疗方法。