实验原理：

　　1. 在ELISA测定中，碱性磷酸酶的色原底物是对**苯磷酸盐(p-nitropheny-phosate，pNPP)。pNPP在碱性磷酸酶的作用下生成对**酚(pNP)，其在入=405 nm处有最大吸收。

　　2. 由于较高浓度的无机磷可竞争性地抑制碱性磷酸酶的活性，所以用TBS体系，不能用含磷酸根丰富的PBS体系，否则会造成本底偏高。

　　3. 由于碱性条件下pNP的光吸收增强，并可使碱性磷酸酶失活，因而可使用氢氧化钠作为终止剂。

　试剂：

　　ELISA溶液体系：

　　1XTBS 1L体系

　　H2O 定容至1000ml

　　Tris-HCl 6.06g 50mM 盐酸调 PH 7.5

　　NaCl 8.76g 150mM

　　包被液：

　　0.1M NaHCO3 (pH9.6)。过滤除菌，4℃贮存。

　　显色液：

　　1. 0.1M glycine pH 10.4 + 1mM MgCl2 + 1mM ZnCl2

　　配方：7.51g glycine + 203 mg MgCl2 + 136 mg ZnCl2 + 980 ml H2O，用浓NaOH溶液调至pH10.4，补水定容到1L。

　　2. 1 M diethanolamine(二乙醇胺)pH 9.8+ 0.5mM MgCl2

　　配方：97 ml of diethanolamine +100 mg MgCl2 + 800 ml H2O，用浓HCl溶液调至pH9.8，补水定容到1L。

　　显色液中pNPP终浓度为1mg/ml。

　　终止液：

　　配方：3M NaOH。

　　实验步骤：

　　1. 包被：用包被液稀释靶分子，4℃过夜或者37℃ 1h。TBS洗3次。

　　2. 封闭：2%M-TBS 37℃ 1h。TBS洗3次。

　　3. 结合：将表达菌用TBS重悬，超声后加入到孔中，37℃ 1h。0.5%TBST洗3次。

　　4. 显色：将显色液加入到孔中，3M NaOH终止(100ul显色液+25ul终止液)

　　实验结论：

　　两种显色液显色时间有区别，显色液1显色较慢，适合检测表达量较高或结合活性高的样本，同时实验平行性较好;显色液2显色较快，灵敏度较高。

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