全基因组拷贝数变异（Copy Number Variation，CNV）在肿瘤的研究中占据十分重要的地位。目前，CNV已被多项研究证明参与了癌症的发生和发展，其数量和复杂程度更是许多癌症的预后指标。2013年9月Nature杂志发表了一篇对3299份来自于12种实体瘤样本的研究，结论表明肿瘤可以依据驱动因素，分为M class (mutation driven，基因突变驱动) 和C class (copy number driven，拷贝数变异驱动)。其中，卵巢癌、乳腺癌、肺(鳞)癌及头颈癌等癌症中，CNV类型的驱动突变多于基因突变。这充分表明了CNV在肿瘤研究中的重要性。
上海伯豪生物技术有限公司（Shanghai Biotechnology Corporation）作为上海生物芯片有限公司/生物芯片上海国家工程研究中心旗下的专业技术服务子公司，在FFPE样品检测服务领域有多年服务经验，为客户整合推出OncoScanTM FFPE检测服务分析全面解决方案。
一． 产品介绍
福尔马林固定、石蜡包埋（formalin fixation and paraffin embedding，FFPE）是肿瘤医学领域常见的样本形式。FFPE样本通常珍贵且保存时间长，存在样本量稀少和高度降解的问题。因此，从FFPE 组织中获得CNV变异信息，是一个巨大的挑战。Affymetrix 公司的OncoScan™ FFPE检测产品针对降解状态的FFPE样本，开发了分子倒置探针（MIP）技术，并针对891个癌症相关基因加密设计了探针，以提高检测分辨率。在一个试验中轻松完成拷贝数变异和杂合性缺失(LOH)检测，并能检测常见的获得性突变。
Affymetrix OncoScan™ FFPE芯片特点
- 使用分子倒置探针(MIP)技术，针对FFPE样本优化设计（探针结合处只需40bp的碱基）；
- 经7000多个样本验证，试验成功率>90%；
- 所需起始DNA量少，陈旧FFPE样本也有效(10年或者更久)；
- 针对约900种癌基因，能达到50-100kb拷贝数的分辨率；
- 癌基因外的全基因扫描，可达到300kb的分辨率；
- 可检测全基因组LOH缺失，包括拷贝数中性的LOH（copy neutral LOH）；
- 检测动态范围可以高达10拷贝以上；
- 对关键癌基因如ERBB2 (Her2)、EGFR、MDM2、MYCFGFR1等，证实与FISH验证的扩增一致。
通过OncoScan™ FFPE观察样本的CNV和LOH
拷贝数探针强度（log2ratio）与B等位基因频率（B-Allele Frequency, BAF）的结果是判断样本是否发生了CNV和LOH的直接依据。图2展示了拷贝数增加（左圈）和减少（右圈）的示例。
在图2案例中，拷贝数增加使log2ratio大于0，且等位基因由2个等位基因增加为3个，因此BAF出现了4条带型，带型的频率分布根据肿瘤样本和正常样本的比例决定（表2）。拷贝数减少也会出现4个带型，原理相似。
OncoScan™ FFPE可反映样本的亚克隆结构
肿瘤样本具有高度异质性，通过OncoScan™ FFPE芯片的分析，可以观察样本中的亚克隆结构。图3展示了样本中存在2个亚克隆时的情况。2个克隆由于在组织中占比不同，因此发生缺失时log2ratio将出现2个小于0的不同数值，且BAF带型也将呈现两种状态（见表2）。
二． 样本要求
样本准备及建议：
FFPE切片（10片左右,切片厚度10um左右）
样品量要求
- 样品纯度：RNA 应该去除干净；
- 样品浓度：浓度不低于12ng/µl；
- 样品溶剂：溶解在Reduced TE（10mM Tris, pH 8,0，0.1mM EDTA）中；
- 样品运输： DNA低温运输（-20℃）；在运输过程中请用parafilm将管口密封好，以防污染。
三． 基础分析内容
3.1 CNV和LOH结果统计
Affymetrix Genechip Scaner产生的芯片原始数据cel文件，用CHAS(Chromosome Analysis Suite)软件进行分析将Cel文件转换成CYCHP文件，导出每个样本CNV及LOH结果总表、样本的CNV及LOH染色体分布图和每个样本log2Ratio、BAF总图。
3.2 CNV和LOH结果可视化
借助CHAS软件分染色体展示拷贝数变异和LOH。其中CNV用蓝色（扩增）与红色（缺失）表示，LOH用紫色表示。
CHAS软件也可以同时展示多个样本的CNV或LOH结果，用于直观比较多个样本的相同和差异。
CHAS软件可将单个样本的拷贝数探针(log2ratio)与SNP探针(BAF)的结果用图形展示出来。图8为展示结果，X轴为染色体，Y轴为log2ratio或BAF。
四． 高级分析内容
4.1多样本CNV频数分析
在进行多个样本分析时，可统计多个样本的CNV频数，直观发现样本之间的相似性和差异性。在下图中，柱高代表该CNV区段在样本中所占比例，向上为拷贝数增加，向下为拷贝数减少，不同颜色代表不同拷贝数状态。
4.2显著高频CNV统计
GISTIC是使用频率较高的CNV显著性统计软件，可找出多个样本（一般大于20个）中显著高频出现的CNV，用于推测驱动CNV变异。另外，GISTIC可根据CNV占染色体比例，将CNV区分为broad events和focal events。在对每个样本进行分析时，GISTIC计算了各基因区域的G-score，反映了CNV的变化幅度和其在样本之间的出现频率。下图展示了各样本的G-score染色体排布，可观察样本之间CNV发生情况。
下图为GISTIC的主要结果，展示了扩增和缺失的显著区域。红色为拷贝数增加，蓝色为拷贝数减少，超出阈值的区段为显著性CNV区段。
4.3 CNV相关基因富集分析
在癌症发展中，具有驱动作用的CNV变异由于具有选择优势，可能会受到富集作用。因此，可对CNV中包含的基因进行GO、KEGG和疾病类型的富集分析，观察是否有某些基因功能、通路或疾病类型被显著富集。在下图中，纵坐标表示Go term，横坐标是富集因子（Rich Factor = Gene number/Total Gene Number of the term）。每个圆圈的大小与在这个Go Term上的基因成正比，颜色与根据q-value的log值从红到绿渐变。颜色越红，则q-value值越低，富集越显著。
4.4 CNV聚类热图展示
在肿瘤研究样本数较多的情况下，可对所研究的个体进行聚类，方便对具有相似CNV发生特征的个体进行分组；也可对发生CNV的染色体区域进行聚类，寻找相似的癌症相关基因。
下图为根据GISTIC结果，对样本的G-score进行聚类。左上图例：不同颜色代表不同拷贝数，折线图表示具有该拷贝数的windows（以2Mb为单位统计）数量；右上图例：个体表型分类；左下图例：不同颜色代表不同染色体。
也可同时对样本和染色体区域进行聚类，如下。
另外，也可根据绝对拷贝数进行聚类分析，如下图所示。
4.5组间差异基因CNV统计
在肿瘤基因组研究中，常需统计原发和转移组，或者用药敏感或非敏感组等之间的CNV差异。常见的统计方法如下：
（1） 寻找样本之间共同的CNV，并以CNV区段为单位进行fisher检验；
（2） 以基因为单位，使用fisher检验统计两组样本中基因拷贝数变化的差异；
（3） 以GISTIC结果中基因的G-score为单位，在两组样本中使用t检验统计差异基因。
4.6基于机器学习模型筛选生物标志物
SVM（Support Vector Machine，支持向量机）是一个有监督的学习模型，通常用来进行模式识别、分类以及回归分析，能够较好的解决小样本的分类问题。在癌症研究中，常需要对用药前后，转移和非转移等分组进行特征性分子标志物的筛选。分类效果的好坏可以用ROC曲线（Receiver Operator Characteristic curve）对所筛选基因的准确性进行可视化展示。ROC曲线越靠近左上角，分子标志物筛选准确性就越高，当AUC值（Area Under the Curve）大于0.9时说明模型较为可靠。
