自噬相关基因3(ATG3)是一种主要以在LC3脂化过程中发挥作用而闻名的酶。ATG3是否在脂质代谢中发挥作用或参与酒精性脂肪肝病(NAFLD)的发生发展尚不清楚。
来自西班牙的研究团队在Journal of Hepatology（中科院JCR一区，IF:25.083）发表了题为“Inhibition of ATG3 ameliorates liver steatosis by increasing mitochondrial function”的论文。
研究者通过蛋白质组学检测了不同小鼠脂肪变性模型中的蛋白变化，并发现了一个与脂质代谢相关的差异变化蛋白——ATG3。ATG3在动物模型和NAFLD患者的肝脏高表达，且可以调控脂质代谢和线粒体活性，是一种与脂肪变性发生发展有关的新蛋白。
研究背景
转录因子p63属于一个由p53、p63和p73组成的家族，是导致肝脂肪变性发展的众多因素之一。p63编码多种亚型，可分为2类：具有酸性反转活化结构域(TA)的亚型和没有该结构域的亚型（结构域阴性的亚型）。TAp63α亚型在NAFLD动物模型的肝脏和NAFLD肥胖患者的肝脏活检中均升高。此外，在饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠的肝脏中，p63α的下调可减轻肝脏脂肪变性，而TAp63α的激活可通过IKKβ和内质网应激的激活增加肝脏脂肪含量。
本研究，作者通过蛋白质组学检测了TAp63α基因过表达或敲低的小鼠肝脏中参与脂质代谢的新蛋白。小鼠肝组织蛋白质组学实验设计：
实验组1：肝组织特异性过表达TAp53α诱导的脂肪变性小鼠（n=3）
对照组1：正常小鼠 （n=3）
实验组2：胆碱缺乏高脂食物（CDHFD）诱导的非酒精性脂肪肝小鼠 肝组织特异性敲低p63α（n=3）
对照组2：胆碱缺乏高脂食物（CDHFD）诱导的非酒精性脂肪肝小鼠 肝组织对照（n=3）
研究结果
一、肝脏ATG3受p63的调节，且在饮食诱导的脂肪变性动物模型中高表达
前述两种实验设计下的肝脏蛋白质组学分析确定了肝脏脂质积累的新途径和调节因子。p63正向调控43个蛋白，并显示了代谢相关蛋白的富集，线粒体为受影响最大的细胞成分。热图显示了一些参与脂质代谢的蛋白，它们受p63过表达的正调控，包括ATG3。考虑到脂吞噬在调节脂肪酸代谢中的相关作用，以及ATG3之前没有被报道与肝功能相关，作者选择了这个候选基因进行进一步研究。当肝脏中过表达TAp63α时ATG3 mRNA和蛋白水平上调，而当抑制DIO（饮食诱导肥胖）小鼠肝脏中的TAp63α时，ATG3 mRNA和蛋白水平降低。
二、NAFLD（非酒精性脂肪肝疾病）患者肝脏中的ATG3升高
在NAFLD患者（25例非酒精性脂肪肝（NAFL）和30例非酒精性脂肪性肝炎（NASH））肝活检组织中检测到了比健康肝脏高的ATG3。ATG3与脂肪变性分级、NAFLD活性评分和脂肪肝指数（呈正相关。肥胖(BMI>30)患者与非肥胖(BMI<30)患者相比，ATG3水平升高，并与BMI呈正相关。总之，这些结果表明，在NAFLD患者中存在较高的ATG3水平。
三、ATG3增加了人肝细胞的脂质含量，降低了β-氧化
ATG3 mRNA和脂质含量在经油酸(OA)处理的人肝THLE2细胞增加。然而，ATG3沉默后减少了OA诱导的脂质存储。如前报道，TAp63α过表达增加了肝细胞中的脂滴，但当ATG3被沉默时，这种作用减弱。在另一种人肝细胞系HepG2中进行的类似实验也得到了相同的结果。最后，作者从小鼠中分离肝细胞并用OA处理，在转染siATG3和磷酸化的ATG3后，分别检测到了脂肪酸β-氧化的增加和减少。
四、ATG3调节肝细胞线粒体活性
在HepG2细胞中过表达ATG3降低了耗氧率。更具体地说，ATG3过表达后，基础呼吸、ATP相关呼吸、质子泄漏、最大呼吸和24小时非线粒体耗氧量均降低。这些结果与线粒体复合物II(II-SDHB)、III和V的蛋白水平降低相一致。脂肪酸合酶(FAS)、乙酰辅酶A羧化酶或肉碱棕榈酰基转移酶1a(CPT1a)的蛋白水平均无变化。然而，ATG3的诱导降低了过氧化物酶体增殖物激活受体伽马共激活物1α(PGC1a)和sirtuin1(SIRT1)，这两种是促进线粒体功能和脂肪酸氧化的蛋白。HepG2细胞中的ATG3抑制得到了相反的结果。以上这些结果也在THLE2细胞中得到了证实。
五、抑制肝脏ATG3可改善TAp63α诱导的脂肪变性
作者接下来评估了抑制ATG3对TAp63α诱导的小鼠脂肪变性的影响。TAp63α过表达后，循环天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转氨酶（ALT）水平升高。抑制ATG3可降低AST和ALT水平。TAp63α的过表达导致肝脏脂肪变性，这种作用被ATG3敲低所减弱。在机制上，TAp63α过表达的小鼠脂肪酸合成酶（FAS）水平升高，CPT1a、PGC1a和SIRT1水平降低。抑制ATG3可使CPT1a、PGC1a和SIRT1的水平恢复到对照组的水平。肝脏过表达TAp63α降低了所有线粒体复合物的水平，而抑制ATG3则使肝脏复合物I和II的水平恢复正常。
六、ATG3需要SIRT1来调节脂质代谢和线粒体活性
接下来，作者评估了SIRT1作为ATG3的潜在调节因子的功能相关性。在HepG2细胞中沉默ATG3可以改善OA诱导的脂质负荷。然而，当SIRT1也被沉默时，干扰ATG3未能降低OA诱导的脂质含量。这些结果也在共转染siATG3和siSIRT1的THLE2细胞中得到了证实。此外，在SIRT1沉默后，siATG3在THLE2细胞中诱导的较高的耗氧速率也消失了。SIRT1被白藜芦醇药理激活后，ATG3诱导的脂质含量减少。在分离的肝细胞中，ATG3也降低了耗氧率，而白藜芦醇则减弱了这种作用。与这些结果相一致，沉默ATG3增加了SIRT1的活性，降低了PGC1a的乙酰化水平，而ATG3过表达则降低了分离的肝细胞中SIRT1的活性。
体内实验中，作者对喂食CDHFD的小鼠先后沉默ATG3和SIRT1。在ATG3基因敲低后，AST和ALT均降低，而当ATG3和SIRT1均被沉默时，这种降低被消除。当SIRT1被抑制时，ATG3下调小鼠脂质含量和肝脏甘油三酯的功能被减弱。肝脏ATG3的敲低导致了CPT1a蛋白水平的增加以及复合物II活性的提高，但这些作用被共沉默ATG3和SIRT1所阻断。因此，ATG3需要SIRT1来调节脂质代谢和线粒体活性。
七、ATG3通过JNK1调控SIRT1蛋白水平
调控SIRT1蛋白水平的关键因子是c-Jun N端激酶1(JNK1)，其激活诱导SIRT1蛋白降解，而JNK2诱导SIRT1蛋白稳定性。作者检测了用CDHFD喂养的小鼠肝脏中的JNK1和JNK2，在肝脏中ATG3被敲除，检测到JNK1水平降低，而JNK2水平没有降低。细胞数据与体内实验数据一致。最后，用JNK1抑制剂SP600125处理分离的肝细胞，可减弱ATG3诱导的作用，包括增加脂质含量、降低耗氧率和SIRT1活性。
八、ATG3需要CPT1a来调节脂质代谢和线粒体活性
CPT1a floxed小鼠注射AAV8-GFP（对照）或AAV8-Cre；第4周，实验组注射干扰shRNA（对照）或shRNA-ATG3，第8周牺牲掉小鼠。经AAV8-Cre或shRNA-ATG3处理后，肝脏中的CPT1a和ATG3水平分别降低，而肝脏质量不受影响。但在ATG3基因敲低后，AST和ALT水平降低。当ATG3和CPT1a均被沉默时，它们恢复到基线水平。当CPT1a敲低后，原本ATG3下调导致的小鼠脂质和肝脏甘油三酯降低以及复合物II和IV水平的升高被削弱。这些结果表明，ATG3需要CPT1a来调节脂质代谢和线粒体活性。
九、ATG3以不依赖自噬的方式调节肝脂质含量
作者进一步探索ATG3是否通过自噬依赖的方式发挥作用。在自噬诱导后，微管相关蛋白1轻链3α(MAP1LC3A或LC3)被脂化，LC3-磷脂偶联物(LC3-II)被招募到自噬体膜，与溶酶体融合形成自溶酶体，降解自噬体内成分和LC3-II。与预期的一样，在HepG2细胞沉默ATG3则降低了LC3-II水平。紧接着，在存在或不存在溶酶体介导的蛋白质水解抑制剂氯喹(CQ)的情况下，作者通过分析LC3-II周转来监测自噬通量。CQ给药诱导了预期的LC3-II积累。用OA处理和转染siATG3的肝细胞储存了较少的脂质，而CQ处理增加了脂质含量。然而，在过表达ATG3的细胞中，CQ抑制自噬并不影响ATG3诱导的THLE2或HepG2细胞中的脂滴。因此，这些结果表明，ATG3诱导的脂质积累不依赖于自噬。这在体内实验中得到了证实，因为在两个脂肪变性动物模型(由TAp63α过表达或CDHFD诱导)中，ATG3敲低减少了LC3-II的积累，但不影响成熟的自噬标记物如ATG5、ATG7和p62的蛋白和mRNA水平。总之，这些数据表明ATG3对脂质含量的影响独立于自噬作用。
研究总结
作者使用蛋白质组学检测了TAp63α过表达诱导的小鼠脂肪变性模型的蛋白变化以及CDHFD诱导的小鼠脂肪变性模型在TAp63敲低后的蛋白表达变化。研究发现自噬相关基因3(ATG3)通过TAp63α的激活而上调，而在TAp63α的抑制后则被下调。ATG3在一些NAFLD动物模型和NAFLD患者的肝脏中升高。ATG3基因过表达增加了肝细胞的脂质负荷，而其抑制则减轻了TAp63α和饮食诱导的脂肪变性。ATG3通过调节SIRT1和线粒体功能发挥脂质代谢作用。总体来说，作者的研究确定了ATG3是一个与脂肪变性发展有关的新基因。
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接下来，作者评估了SIRT1作为ATG3的潜在调节因子的功能相关性。在HepG2细胞中沉默ATG3可以改善OA诱导的脂质负荷。然而，当SIRT1也被沉默时，干扰ATG3未能降低OA诱导的脂质含量。这些结果也在共转染siATG3和siSIRT1的THLE2细胞中得到了证实。此外，在SIRT1沉默后，siATG3在THLE2细胞中诱导的较高的耗氧速率也消失了。SIRT1被白藜芦醇药理激活后，ATG3诱导的脂质含量减少。在分离的肝细胞中，ATG3也降低了耗氧率，而白藜芦醇则减弱了这种作用。与这些结果相一致，沉默ATG3增加了SIRT1的活性，降低了PGC1a的乙酰化水平，而ATG3过表达则降低了分离的肝细胞中SIRT1的活性。
体内实验中，作者对喂食CDHFD的小鼠先后沉默ATG3和SIRT1。在ATG3基因敲低后，AST和ALT均降低，而当ATG3和SIRT1均被沉默时，这种降低被消除。当SIRT1被抑制时，ATG3下调小鼠脂质含量和肝脏甘油三酯的功能被减弱。肝脏ATG3的敲低导致了CPT1a蛋白水平的增加以及复合物II活性的提高，但这些作用被共沉默ATG3和SIRT1所阻断。因此，ATG3需要SIRT1来调节脂质代谢和线粒体活性。
七、ATG3通过JNK1调控SIRT1蛋白水平
调控SIRT1蛋白水平的关键因子是c-Jun N端激酶1(JNK1)，其激活诱导SIRT1蛋白降解，而JNK2诱导SIRT1蛋白稳定性。作者检测了用CDHFD喂养的小鼠肝脏中的JNK1和JNK2，在肝脏中ATG3被敲除，检测到JNK1水平降低，而JNK2水平没有降低。细胞数据与体内实验数据一致。最后，用JNK1抑制剂SP600125处理分离的肝细胞，可减弱ATG3诱导的作用，包括增加脂质含量、降低耗氧率和SIRT1活性。
八、ATG3需要CPT1a来调节脂质代谢和线粒体活性
CPT1a floxed小鼠注射AAV8-GFP（对照）或AAV8-Cre；第4周，实验组注射干扰shRNA（对照）或shRNA-ATG3，第8周牺牲掉小鼠。经AAV8-Cre或shRNA-ATG3处理后，肝脏中的CPT1a和ATG3水平分别降低，而肝脏质量不受影响。但在ATG3基因敲低后，AST和ALT水平降低。当ATG3和CPT1a均被沉默时，它们恢复到基线水平。当CPT1a敲低后，原本ATG3下调导致的小鼠脂质和肝脏甘油三酯降低以及复合物II和IV水平的升高被削弱。这些结果表明，ATG3需要CPT1a来调节脂质代谢和线粒体活性。
九、ATG3以不依赖自噬的方式调节肝脂质含量
作者进一步探索ATG3是否通过自噬依赖的方式发挥作用。在自噬诱导后，微管相关蛋白1轻链3α(MAP1LC3A或LC3)被脂化，LC3-磷脂偶联物(LC3-II)被招募到自噬体膜，与溶酶体融合形成自溶酶体，降解自噬体内成分和LC3-II。与预期的一样，在HepG2细胞沉默ATG3则降低了LC3-II水平。紧接着，在存在或不存在溶酶体介导的蛋白质水解抑制剂氯喹(CQ)的情况下，作者通过分析LC3-II周转来监测自噬通量。CQ给药诱导了预期的LC3-II积累。用OA处理和转染siATG3的肝细胞储存了较少的脂质，而CQ处理增加了脂质含量。然而，在过表达ATG3的细胞中，CQ抑制自噬并不影响ATG3诱导的THLE2或HepG2细胞中的脂滴。因此，这些结果表明，ATG3诱导的脂质积累不依赖于自噬。这在体内实验中得到了证实，因为在两个脂肪变性动物模型(由TAp63α过表达或CDHFD诱导)中，ATG3敲低减少了LC3-II的积累，但不影响成熟的自噬标记物如ATG5、ATG7和p62的蛋白和mRNA水平。总之，这些数据表明ATG3对脂质含量的影响独立于自噬作用。
研究总结
作者使用蛋白质组学检测了TAp63α过表达诱导的小鼠脂肪变性模型的蛋白变化以及CDHFD诱导的小鼠脂肪变性模型在TAp63敲低后的蛋白表达变化。研究发现自噬相关基因3(ATG3)通过TAp63α的激活而上调，而在TAp63α的抑制后则被下调。ATG3在一些NAFLD动物模型和NAFLD患者的肝脏中升高。ATG3基因过表达增加了肝细胞的脂质负荷，而其抑制则减轻了TAp63α和饮食诱导的脂肪变性。ATG3通过调节SIRT1和线粒体功能发挥脂质代谢作用。总体来说，作者的研究确定了ATG3是一个与脂肪变性发展有关的新基因。
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