基因敲除技术最新研究进展—|基因敲除技术|转基因研究|基因克隆|基因靶向操作|-分析方法-资讯-生物在线

基因敲除技术最新研究进展—|基因敲除技术|转基因研究|基因克隆|基因靶向操作|

作者:威斯腾生物 2014-08-14T00:00 (访问量:25425)

 

 基因敲除技术最新研究进展—|基因敲除技术|转基因研究|基因克隆|基因靶向操作|

 

基因敲除技术是建立在基因同源重组技术以及胚胎干细胞技术的基础上而发展起来的一种分子生物学技术。1987年Thompsson建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型 。近年来新兴起了ZFNs、TALENS、Cas9等多种基因高效靶向修饰和调控技术为主的基因敲除技术。2012年1月基因组编辑核酸酶技术的《Nature Methods>杂志评选为年度研究方法,2012年12月被Science杂志评为2012年度十大科学进展之一。这些基因敲除技术极大地提高了基因敲除的效率,且具有极高的基因敲除特异性,为研究基因功能创造了新的途径必将极大地推动生物学、医学研究的发展。现常用的基因敲除技术主要包括以下几类。

1 传统基因敲除方法

1.1 利用同源重组进行基因敲除

基因敲除,又称基因打靶,是一种遗传工程技术,是在转染细胞中发生外源打靶基因与核基因组目标基因之间的DNA同源重组,能够使外源基因定点地整合到核基因组的特定位置上,从而通过基因敲除达到改变细胞遗传特性的目的传统的基因敲除技术依赖于细胞内自然发生的同源染色体的随机交换,但在体细胞内,基因同源重组的效率特别低,增加了基因敲除实际操作的工作量,限制了基因敲除技术的应用。而且,用单纯的同源重组实现人类基因组的永久修复是不切实际的,这也严重阻碍了生物学研究的发展 。

1.2 利用随机插入突变进行基因敲除

大规模的随机插入突变理论上可实现在基因组范围内对任一基因敲除。这项技术可提高基因敲除效率,使基因完全失活以及容易分离鉴定等优点。目前较为有效的基因敲除方法是随机插入突变可以分为T-DNA插入突变和转座子插入突变,两者是在植物中使用广泛的基因敲除手段。T-DNA插入失活技术可以直接植物基DNA中产生稳定的插入突变,而且插入位点的随机性较强,但是只适用于那些容易被T-DNA转化的植物,且常常会引起染色体重排现象,使突变体表型与T-DNA插入无关而难以进行遗传学分析。这种基因敲除方法在拟南芥中可产生35% ~40%的突变率,19% 的突变体具有外观可察觉到的表型特征。近年这类基因敲除方法在拟南芥研究应用广泛 。

2 新兴的基因敲除技术

2.1 利用RNA干扰引起的基因敲除

RNA干扰是RNA依赖的基沉默现象是双链RNA分子在mRNA水平上诱发的序列特异性的转录后基因表达沉默。dsRNA在Dicer酶的作用下可产生一系列长度为21~22 nt的siRNA,siRNA分子、核酸酶以及螺旋酶等结合形成RNA诱导沉默复合物,R1SC以ATP依赖的方式催化双链siRNA解旋,利用RISC内部的单链siRNA,通过碱基配对识别与之互补的靶RNA,切割靶RNA,并由RNA酶降解,从而导致的基的沉默。此,通过将dsRNA分子导人细胞内,特异性地降解细胞内与其同源的mRNA,封闭内源性基的表达来失活该基同样可以实现敲除

2.2 锌指核酸酶基因打靶技术基因敲除

锌指核酸酶基打靶技术的核心设计思想是将2个有特定功能的结构域,即特异性识别模块和功能模块融合,形成具有特定功能的蛋。单个ZFN的DNA结合结构域一般包含3~6个Cys2一His2锌指蛋重复单位,能特异性识1联体碱基。与锌指蛋白组相连的非特异性核酸内酶来Fokl的c端的96个氨基酸残基组成的DNA剪切域,每个Fokl单体与一个锌指蛋门组相连构成一个ZFN,识别特定的位点,当2个识别位点相距6~8bp距离时,2个单ZFN相互作用产生酶切功能。在此特异位点产生1个DNA双链切,然后利细胞有的同源重组或非同源末端连接修复机制进行切修复从而达到精确定点修饰的目的 。ZFN介导的基因敲除技术可以精确地修饰基因或其周的调控元件,为研究人类疾病构建良好的动物模型,通过原核注射或胞质注射获得的基因敲除大鼠、基因敲除兔。存在同源的外源DNA时,发生同源重组修复,能实现外源基的定点敲入。

2.3 利用TALEN切割特定的核苷酸靶序列引起的基因敲除

TALENs靶向基因敲除技术是一种崭新的分子生物学具,被认为是基因敲除技术发展的程碑TALENs靶向基因敲除计和构建是基于植物病原体黄胞菌分泌的一种转录激活子样效应因子可以识别DNA序列的原理。利TAL的序列模块,可组装成特异结合任意DNA序列的模块蛋。TAL蛋白的DNA结合域与Fokl核酸内切酶的切割域融合,特异的位点打断标基,进而在该位点进行DNA操作,如基因(Knock—in)、基因(Knock—nut)或点突变

2.4 Cas9基因敲除技术

2013年初,一种全新的人工核酸内切酶clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR/Cas9),主要细菌和古细菌通过一种不断进化适应的免疫防御系统改造而成II型CRISPR/Cas9免疫系统依赖Cas9内切酶家族靶向和剪切外源DNA,达到基因敲除目的。Cas9基因敲除技术特点是制作简单,成本低,作用高效 。CRISPR/Cas9将进一步靶向基操纵推向高潮,使得多个基因敲除、敲变得更为简单、高效。作为一种新的基因编辑技术,CRISPR/Cas9有靶向精确性高、试验周期短、物种限制、具有好的活性等特点和优势。不仅此,CRISPR/Cas9基因敲除系统还可以同时针对同一细胞(Es)的多个位点能实现多靶点同时酶切,人们运用该技术成功获得斑马鱼等模式动物基因敲除模型,使得多个基因敲除、敲成为可能。虽然前对该技术的特异性及免疫原性了解甚少,但随着研究的不断深入,一定会有很大的改善。

尽管利用人工核酸酶ZFN、TALENs和细菌获得性免疫系统CRISPR这类基因敲除技术目前还处于研究的初期阶段,其在基因敲除方面已表现出巨大的潜力和广阔的应用前景,被认为是靶向基因修饰的革新技术。由于这些新技术依然还有许多未知因素并没有研究透彻,因此,在基因敲除技术方法的研究过程中,它们发挥的作用将不可限量

 

 

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