睾丸间质细胞（Leydig cells，LC）负责男性95%以上的睾酮合成和分泌，对男性表型、内分泌稳态和生殖功能的发展和维持必不可少。然而，与睾酮合成相关的关键基因的有害突变会导致睾酮水平降低，最终导致睾丸间质功能衰竭（LCF）。以往的研究表明AAV8介导的基因治疗在Lhcgr缺陷小鼠模型中显示出对LCF的治疗潜力，然而，基因治疗的小鼠仍然不能自然生育后代，表明经AAV8治疗小鼠的睾酮和精子发生适度恢复仍然不足以支持自然生育能力。本研究对AAV血清型进行了广泛筛选，以确定对LC细胞祖细胞靶向效率更强的载体，并评估了AAV介导的基因治疗对LCF小鼠睾酮水平、性发育和精子发生的影响。

1、AAVDJ-Lhcgr有效靶向LC祖细胞，并促进Lhcgr^-/-小鼠生殖器官发育

将11种不同衣壳的AAVs（AAV1、2、5、6、7、7m8、8、9、rh10、anc80和DJ），以不同剂量注射到小鼠睾丸间质中，荧光观察发现AAVDJ驱动睾丸内最有效的基因表达，与AAV8相比，AAVDJ在Leydig细胞祖细胞中表现出更高的感染效率；并且经AAVDJ-Lhcgr治疗后，Lhcgr^-/-小鼠睾丸中Lhcgr的表达水平和血清睾酮浓度明显增加，LCs功能也得到显著恢复。进一步评估发现AAVDJ-Lhcgr治疗显著改善了Lhcgr^-/-小鼠的生殖器官参数，有效重启了小鼠生殖器官的发育。随后研究团队确定了AAVDJ-Lhcgr疗法是否可以挽救Lhcgr^-/-小鼠的精子发生，组织学分析发现AAVDJ治疗组（8x10⁹ gc/睾丸）的睾丸曲精管直径扩大，精子发生明显，且睾丸中存在成熟精子，精子数量和活力显著增加。

2、AAVDJ-Lhcgr恢复Lhcgr^-/-小鼠生育能力使其产生可生育后代

为了评估基因治疗后Lhcgr^-/-小鼠的生育能力，在AAVDJ-Lhcgr（8x10⁹ gc/睾丸）治疗后4周，将雄性Lhcgr^-/-小鼠与Lhcgr^+/+雌性小鼠共同饲养进行繁殖，6周后，有2只Lhcgr^+/+雌性小鼠分别产下5窝和7窝后代，基因分型分析证实，检测的五只代表性幼崽均为杂合子。进一步的PCR证实AAVDJ不整合到生殖细胞的基因组中。随后，研究团队对通过AAVDJ-Lhcgr基因治疗产生的F1是否能产生F2进行了验证，将F1中的五只成年雄性和五只雌性与相应的Lhcgr^+/+小鼠交配，结果表明所有F1小鼠都能够通过自然交配产生F2，并且表现出与Lhcgr^+/+小鼠相当的正常生育能力。上述结果证明AAVDJ-Lhcgr治疗的Lhcgr^-/-小鼠通过自然交配能够产生可生育的后代。

3、AAVDJ-Lhcgr改善Lhcgr^-/-小鼠的脂肪和肌肉功能并促进骨形成

先前的研究表明睾酮水平低与体脂增加、肌肉质量减少和肌肉功能受损等身体不良影响有关，因此研究人员检测了AAVDJ-Lhcgr治疗对Lhcgr^-/-小鼠这些参数的影响。组织学分析显示，与PBS治疗的小鼠相比，AAVDJ-Lhcgr治疗的Lhcgr^-/-小鼠的附睾脂肪体重比显著降低，附睾脂肪细胞体积较小；胫骨前肌重量及横截面肌纤维面积明显增加。握力测试发现AAVDJ-Lhcgr治疗组小鼠表现出比PBS治疗组小鼠更大的握力，并且悬挂时间增加，表明基因治疗后小鼠肌肉耐力增强；跑步机测试显示，AAVDJ-Lhcgr组小鼠的运动能力显著提高。这些发现证明了AAVDJ-Lhcgr治疗对Lhcgr^-/-小鼠体脂减少、肌肉质量增强和肌肉功能改善的有益作用。进一步研究表明基于AAVDJ的基因治疗有望通过抑制骨髓脂肪积聚和促进Lhcgr^-/-小鼠的骨形成来保护骨骼稳态。

本研究证明了AAVDJ介导的基因治疗作为一种有前景的LCF治疗方法的有效性和安全性。即使在相对较低的剂量下，AAVDJ基因治疗也能显著提高Lhcgr^-/-小鼠的血清睾酮水平，显著改善性发育，并部分促进精子发生。重要的是，AAVDJ介导的基因治疗使Lhcgr^-/-小鼠能够通过自然交配恢复生育能力，从而产生可育后代。此外，这种治疗方法有效地改善了Lhcgr^-/-小鼠的脂肪、肌肉和骨骼功能。这些发现为靶向遗传性LCF或其他生殖疾病的基因疗法的潜在临床应用提供了有力证据。