生产的T4 RNA Ligase 2，即T4 RNA连接酶2，是一种ATP依赖的双链RNA连接酶(double-strand RNA ligase, dsRNA Ligase)，也被称为T4 Rnl2 (gp24.1)，可以用于双链RNA进行分子内的环化连接和分子间的线性连接。T4 RNA Ligase 2与T4 RNA Ligase 1 (R0621)不同的是，对双链RNA中的缺刻(nick)的连接活性要大大高于对单链RNA末端的连接活性。T4 RNA Ligase 2也可用于双链核酸(RNA双链、RNA/DNA杂合链和/或DNA双链)分子内或分子间RNA链的3’羟基和DNA链的5’磷酸基的连接。T4 RNA Ligase 2连接时需要5’磷酸和3’羟基的存在，可以是RNA链或DNA链的5’磷酸基和RNA链的3’羟基之间发生连接反应。

T4 RNA Ligase 2催化dsRNA粘端连接的反应过程如下。首先T4 RNA Ligase 2直接消耗ATP，形成中间产物T4 RNA Ligase 2-AMP，并释放焦磷酸；接着，T4 RNA Ligase 2-AMP与dsRNA的缺刻处相结合，并将AMP从中间产物T4 RNA Ligase 2-AMP中转移至dsRNA缺刻处的5’磷酸末端，形成腺苷酰化缺刻dsRNA中间产物；最后，在T4 RNA Ligase 2的催化下，dsRNA缺刻处的3’羟基进攻该缺刻处的5’磷酸基团，形成3’-5’磷酸二酯键，并释放出AMP。

本产品酶活性高，连接效率高于国外同类竞争产品。本产品催化双链RNA粘端连接的效果请参考图1。

图1. 生产的T4 RNA Ligase 2和N公司的同类产品(Competitor T4 RNA Ligase 2)催化连接dsRNA粘端连接的效果图。 RNA-1：5’-OH-GGGCUUUGCGUGGGUUU-OH-3’；RNA-2 (5’端磷酸化)：5’- pCUAUAGAAACCCACGCAAAGCCC-OH-3’，使用的R0051 Annealing Buffer for RNA oligos (5X)，参考说明书进行退火反应。退火获得的dsRNA，在20µl反应体系中加入图中指定量的本产品或国外N公司的T4 RNA Ligase 2 (T4 Rnl2)，37°C孵育30min进行连接反应，反应完毕后立即取样用15%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析。如图所示，本产品与N公司的产品相比，实际的连接效率约为N公司产品的2倍，在本反应体系中生产的T4 RNA Ligase 2仅需2U就可以非常充分地完成连接反应。

用途：主要用于连接双链RNA中缺刻的连接(即双链RNA的粘端连接)，也可用于双链结构中，RNA 3’羟基与DNA 5’磷酸基的缺刻连接。

来源：大肠杆菌表达的重组蛋白，表达基因为T4嗜菌体T4 RNA ligase 2。

活性单位定义：：One unit is defined as the amount of enzyme required to ligate 0.4 µg of an equimolar mix of a 23-mer and 17-mer RNAs in a total reaction volume of 20 µl in 30 minutes at 37℃.

活性检测条件：50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 400 µM ATP, 37℃孵育30min。

纯度：不含DNA内切酶和外切酶，不含RNA酶，不含***酶。

酶储存溶液：10 mM Tris-HCl (pH7.5), 50 mM KCl, 35 mM (NH4)2SO4, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM DTT, 50% (v/v) Glycerol.

10X Reaction Buffer：500 mM Tris-HCl (pH 7.5 at 25℃), 20 mM MgCl2, 10 mM DTT, 4 mM ATP.

失活或抑制：85℃加热5min可使T4 RNA Ligase 2失活，或加入蛋白酶K或EDTA可抑制其活性。

包装清单：

保存条件：

-20℃保存，至少一年有效。

注意事项：

如果连接底物为ssRNA，推荐使用生产的R0621 T4 RNA Ligase 1等系列产品。

可根据具体应用选择合适的操作方法，可能需准备额外的试剂，如RNase Inhibitor、DEPC水等。

本产品提供的T4 Rnl2 Reaction Buffer (10X)适用于RNA双链中缺刻的连接反应。如果用于RNA/DNA杂合链中RNA 3’羟基与DNA 5’磷酸基的缺刻连接时，需要将反应体系中的MgCl2的终浓度提高至10mM，并在反应体系中加入终浓度为10-15%的PEG8000，这样可以显著提高酶活性，同时不影响反应特性。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.双链RNA或DNA/RNA杂合双链的退火。

将两条单链RNA等摩尔数混合，推荐的终浓度为20µM (10-50µM均可)，90℃孵育1min，然后通过梯度降温至25℃退火形成dsRNA。推荐使用R0051 Annealing Buffer for RNA oligos (5X)，并按照该产品使用说明进行退火反应。DNA和RNA杂合链的退火也可以参考双链RNA的退火条件进行。退火后的双链推荐在-80℃保存。

2.对于双链RNA缺刻的连接，参考下表在冰浴中配制如下反应体系：

注意：
a.由于涉及RNA操作，需要严格按照RNA操作的规范进行，避免RNase污染，相关试剂和耗材需要经过DEPC处理去除RNase或者确保是RNase free的。本反应体系中涉及双链RNA，双链RNA可以耐受RNase A和T1等。如果涉及单链RNA，包括双链退火后存在部分RNA序列是单链的情况，推荐适量添加R0102 RNase Inhibitor。
b.如果同时进行多个连接反应，可以把上表中除Nicked dsRNA Substrate之外的所有溶液和酶提前预混合，然后再分装到各反应管内。
c.反应体系中的Nicked dsRNA Substrate的最终浓度可以达到1µM，在该反应体系中可以确保充分连接。实际使用过程中，例如由于底物量有限等原因，可以适当减少Nicked dsRNA Substrate的用量，例如使最终浓度为0.5µM或0.2µM等。
3.对于RNA/DNA杂合链中RNA 3’羟基与DNA 5’磷酸基的缺刻连接，参考下表在冰浴中配制如下反应体系：

注意：
a.由于涉及RNA操作，需要严格按照RNA操作的规范进行，避免RNase污染，相关试剂和耗材需要经过DEPC处理去除RNase或者确保是RNase free的。本反应体系中涉及双链RNA，双链RNA可以耐受RNase A和T1等。如果涉及单链RNA，包括双链退火后存在部分RNA序列是单链的情况，推荐适量添加R0102 RNase Inhibitor。
b.如果同时进行多个连接反应，可以把上表中除Nicked DNA/RNA Substrate之外的所有溶液和酶提前预混合，然后再分装到各反应管内。
c.反应体系中的Nicked dsRNA Substrate的最终浓度可以达到1µM，在该反应体系中可以确保充分连接。实际使用过程中，例如由于底物量有限等原因，可以适当减少Nicked dsRNA Substrate的用量，例如使最终浓度为0.5µM或0.2µM等。
4.连接反应：37℃孵育30min。如果发现效果欠佳可以尝试25℃孵育2h。为了使连接反应更加充分，可以适当延长连接反应时间。
5.终止反应：反应结束后加入蛋白酶K或EDTA，即可终止反应。

由于T4 RNA Ligase 2热失活需要85℃加热5min，这样可能导致dsRNA或DNA/RNA杂合双链变性，因此通常不建议通过加热方式失活T4 RNA Ligase 2。如果后续无需保持双链状态，则推荐85℃加热5min以失活T4 RNA Ligase 2。

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