研究基因功能的常见方法就是减少或抑制基因的表达，然后进行表型分析。基因沉默主要发生在转录前和转录后两种水平，转录前水平是由于DNA修饰或染色体异染色质化等引起基因不能正常转录，而转录后水平则是通过降解RNA沉默基因的表达。

下面简单介绍几种常见的基因沉默技术，大家可以根据实验需求选择合适的方式进行研究。

一、RNAi

RNAi是最常用的基因沉默技术，由双链dsRNA介导对同源RNA进行降解。dsRNA经核酸内切酶Dicer切割形成约21~23bp siRNA，RNA解旋酶将siRNA双链解开，反义链与RNA诱导沉默复合物RISC形成复合物，最终由siRNA互补结合靶RNA引导核酸酶切割，实现转录后水平的基因沉默。

如果想要短期内实现基因的下调，可以通过化学合成siRNA转染细胞进行实验，但合成的siRNA易被降解，目前主要通过构建表达载体转录得到siRNA。三型启动子常用于表达shRNA，但U6和H1没有细胞特异性，为了满足动物体内特定细胞的基因沉默，采用与shRNA形成过程类似的miRNA骨架设计shRNA，利用二型启动子实现靶基因的特异性下调（详见miRNA骨架设计shRNA）

shRNA和miRNA形成图示

RNAi技术最令人困扰的就是脱靶问题，原本需要完全互补19~23bp RNA才能发生的基因沉默，只要通过miRNA途径仅需11~15bp碱基互补就能产生干扰效果，而且如果脱靶基因与目的基因功能相似，即使这个shRNA产生了干扰作用，也不会达到预期程度的表型，所以需要同步做干扰回复实验来证明siRNA的作用，避免脱靶效应。

二、CRISPR/Cas9

Cas9在基因编辑领域深受关注，起初它是细菌应对病毒感染或外源质粒入侵的防御系统，后来逐渐用于基因敲除。Cas9系统中的crRNA和tracrRNA嵌合形成sgRNA，引导cas9切割基因组DNA，随后通过修复完成基因编辑。对于编码基因来说，主要通过NHEJ修复方式敲除目的基因（非编码lncRNA的敲除详见）

Cas9系统衍生的CRISPRi技术经常用于下调基因的表达，该系统dCas9蛋白丧失了酶切活性不能切割基因组DNA，dCas9结合在启动子区产生的空间位阻抑制了基因的内源转录，下调了基因的表达。另外，将dCas9与转录阻遏结构域（KRAB）融合则会限制DNA的伸展，提高基因的沉默效率。在动物实验中，常用特异性启动子表达dCas9，通过CRISPRi实现特定细胞内的基因沉默。

利用CRISPRi技术抑制不同神经元Syt1基因的表达¹

三、Cas13

除了Cas9用于调控基因表达外，张锋实验室首次发现Cas13a能够靶向切割RNA，后来Cas13家族其他蛋白如Cas13b、Cas13c和Cas13d也被相继报道具有沉默RNA的作用。与Cas9相比，Cas13蛋白不会切割基因组DNA，仅会靶向并沉默RNA，作用具有可逆性，因此，Cas13被广泛用于后天性疾病和RNA病毒感染治疗中。

目前Cas13家族应用最多的是Cas13d CasRx蛋白，CasRx对RNA的切割活性高，并且蛋白分子量小，易被装在aav载体中和sgRNA同步递送到体内，实现动物体内的基因沉默2，Cas13技术为治疗后天代谢性疾病提供了很大的可能。

CasRx介导肝脏内Pcsk9的表达沉默²

Cas13被证实在哺乳动物细胞中具有抗脑膜炎和水疱性口炎病毒的能力³，这为RNA病毒的治疗提供了理论依据。但是RNA病毒在传播过程中会不断变异，RNA序列不断发生变化，靶向RNA病毒的治疗药物可能存在失效的风险。近两年爆发的新冠病毒已经产生了很多突变体，Cas13能否用于新冠的治疗还需要更多实验数据支持。

以上列举了几种常用的基因下调技术，虽各有特色，但作用方式却有相似之处。吉凯基因可以提供以上技术的工具载体，帮助老师实现体内外细胞的基因沉默，快来咨询订购吧！

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