衰老是植物生命周期中不可缺少的过程，而植物激素在叶片衰老过程中起着关键作用，其中脱落酸(ABA)、Ethylene、茉莉酸(JA)和水杨酸(SA)是促进叶片衰老的重要物质。其中ABA介导植物的多种生理过程，如气孔关闭、叶片衰老、种子休眠和渗透调节等。尽管ABA的生物合成和信号转导以及它们的调控已经得到了广泛的了解，但ABA是如何通过转运被调节的还不清楚。
2022年5月，浙江大学丁忠杰教授团队于Journal of Integrative Plant Biology (IF 9.106)发表了题为“RING‐box proteins regulate leaf senescence and stomatal closure via repression of ABA transporter gene ABCG40”文章，通过转录组学及修饰蛋白质组学，研究发现了两种未被鉴定的RING-box蛋白，衰老泛素连接酶1和2 （ULS1和ULS2），并证明其在ABA信号反馈抑制中作为ABCG40依赖的ABA转运负调控因子，控制叶片衰老和气孔关闭，这对ABA转运调控及其对叶片衰老影响的理解提供了帮助。其中，中科新生命为该研究提供了泛素化修饰蛋白质组学服务。
研究材料
野生型拟南芥及其突变体
技术路线
步骤1：缺乏ULS1和ULS2促进叶片衰老；
步骤2：探究ULS1/2的表达模式；
步骤3：ULS1和ULS2功能的丧失促进ABA诱导的叶片衰老；
步骤4：ULS1/2抑制成熟叶片中ABA的积累；
步骤5：RNA‐seq揭示uls1/uls2中高表达ABA的转运基因ABCG40；
步骤6：ULS1/2介导的叶片衰老依赖于ABCG40；
步骤7：ULS1/2参与ABCG40依赖的气孔运动；
步骤8：定量蛋白质组学揭示uls1/uls2中存在差异的泛素化蛋白。
研究结果
1. 缺乏ULS1和ULS2促进叶片衰老
作者首先基于拟南芥现有的基因表达模式，发现两个属于RING‐V组的基因在衰老叶片中表达增加，并将其命名为ULS1和ULS2。接着作者通过生成一个双突变体uls1/uls2，发现其比野生型和单突变型的叶片衰老明显提前，叶片鲜重和叶绿素含量均降低。此外在此双突变体中构建原生启动子驱动的ULSI和ULS2，发现这两个基因均使uls1/uls2的叶片衰老程度恢复到野生型的水平。这些结果表明，ULS1和ULS2参与抑制拟南芥叶片衰老的过程。
图1 ULS1和ULS2功能的丧失促进拟南芥叶片衰老
2. ULS1/2的表达模式
作者通过蛋白荧光表达，发现ULS1和ULS2主要在细胞质和内膜系统中表达，并且在叶绿体中显著富集。为了确定ULS1和ULS2的组织定位，作者构建了由ULS1/2原生启动子驱动的表达GUS的转基因株系（PULS1:GUS和PULS2:GUS），通过GUS染色，发现ULS1和ULS2主要表达在茎和根的维管组织中，在老叶中的表达高于幼叶，同时其在保卫细胞、下胚轴及花中也进行表达。此外，作者使用RT‐qPCR检测发现ULS1和ULS2在未衰老的成熟叶(NL)和老叶(OL)中高度表达，ULS1同样在花和角果中高度表达，表明其主要在成熟和衰老叶片中表达。
图2 ULS1和ULS2的表达模式
3. ULS1和ULS2功能的丧失促进ABA诱导的叶片衰老
为了探讨ULS1和ULS2是如何参与叶片衰老过程的，作者分别用ABA、SA、MeJA、ACC和黑暗条件处理WT和uls1/uls2突变体的未衰老成熟叶片。结果表明，突变体uls1/uls2叶片衰老加速，叶绿素含量较对照组低。值得关注的是，只有ABA对uls1/ uls2突变体叶片衰老的促进作用明显大于WT，这表明ULS1和ULS2可能参与了ABA诱导的叶片衰老。为了验证这一结果，作者测定了WT和uls1/uls2在添加或不添加ABA处理的离体叶片中与衰老相关基因的转录水平。结果表明，与WT相比，uls1/ uls2叶片中叶绿素分解代谢基因(NYC1和NYE2)和衰老特异性基因(SAG12和SAG13)的表达显著增加。此外，ABA能显著提高uls1/uls2叶片中的基因转录水平，其中ULS1和ULS2的mRNA水平明显受到ABA的诱导。这些数据表明，ULS1和ULS2可能在ABA诱导的叶片衰老过程中起负调控作用。
图3 uls1/uls2对ABA诱导的叶片衰老异常敏感
4. ULS1/2抑制成熟叶片中ABA的积累
为了确定ULS1/2如何影响ABA诱导的叶片衰老，作者将拟南芥叶片分为三个发育阶段，即ST1(早熟或幼叶)、ST2(成熟叶)和ST3(老叶)，并分别测量了叶片中的ABA含量。结果表明在WT和uls1/uls2植株中，ABA含量都随着叶片发育而增加。此外，在ST2期，特别是ST3期，uls1/uls2叶片中的ABA积累远高于WT。这些数据表明，ULS1和ULS2可能通过抑制衰老叶片中ABA的积累来抑制叶片衰老。
图4 突变体植株成熟叶中ABA含量增加
5. RNA‐seq揭示uls1/uls2中高表达ABA的转运基因ABCG40
为了进一步探索ULS1和ULS2调控叶片衰老的分子机制，利用RNA‐seq对WT和uls1/uls2不同阶段叶片中差异表达基因进行了鉴定。结果表明，在三个发育阶段均有显著性差异的50个基因中，ABA转运体基因ABCG40的差异表达最为显著，并通过RT-qPCR证实了这一结果。此外，在uls1/uls2离体叶片中，ABCG40的表达水平要高得多，且在ABA处理后进一步增强。这些结果表明，ABCG40的高表达可能是uls1/uls2突变体ABA积累和叶片衰老的原因之一。
图5 uls1/uls2叶片在不同发育阶段的差异基因表达
6. ULS1/2介导的叶片衰老依赖于ABCG40
紧接着作者开始验证ULS1和ULS2是否通过ABCG40调节叶片衰老。他们通过构建三重突变体uls1/uls2/abcg40，发现相比较于uls1/uls2，三重突变体在叶片衰老过程中表现出类似WT的表型。此外，与uls1/uls2相比，uls1/uls2/abcg40中衰老相关基因SAG12和NYC1的表达显著降低。这些结果表明，在缺乏ULS1和ULS2的植物中，ABCG40是导致叶片早期衰老的主要因素。为了进一步证实ABCG40是否有助于增加uls1/uls2中ABA的积累，作者测定了ST3期叶片中的ABA含量，发现uls1/uls2/ ABCG40中ABA的积累明显低于uls1/uls2。综上这些数据表明，缺乏ULS1和ULS2会增加ABCG40的表达，进而促进叶片中ABA的积累，导致叶片加速衰老。
图6 ULS1和ULS2通过ABCG40参与叶片衰老
7. ULS1/2参与ABCG40依赖的气孔运动
由于ABA诱导的气孔关闭需要ABCG40，因此作者接下来探究ULS1和ULS2是否参与气孔运动的调节。与WT相比，在对照和ABA处理下，uls1/uls2的气孔孔径显著减小，而abcg40突变可以很大程度上抑制uls1/uls2的气孔关闭，这表明ULS1/2在ABCG40依赖的气孔运动中起作用。与此一致的是，uls1/uls2的叶片失水率明显低于WT和uls1/uls2/abcg40突变体。
图7 ULS1和ULS2通过ABCG40调节气孔孔径
8. 定量蛋白质组学揭示uls1/uls2中存在差异的泛素化蛋白
接下来文章进一步挖掘ULS1/2如何影响ABCG40的表达。作者从4周龄的WT和uls1/uls2植物中取样未衰老的成熟叶片，通过Label Free定量蛋白质组学检测体内泛素化。结果表明共有65个在WT和uls1/uls2之间泛素化差异显著的蛋白，其中15个蛋白参与ABA响应和衰老过程，支持ULS1/2在ABA诱导的叶片衰老中的作用。此外，ABC转运蛋白，特别是ABCG40，是uls1/uls2中泛素化水平最高的蛋白之一，表明ABCG40在uls1/uls2植物中丰富，其泛素化受到ULS1/ULS2的间接影响。
图8 定量蛋白质组学揭示了WT和uls1/uls2植物中存在差异的泛素化蛋白
小编小结
文章作者研究发现了两个新的RING家族基因ULS1和ULS2，其通过抑制依赖于ABCG40的ABA运输来调节叶片衰老和气孔关闭，为ABA转运在叶片衰老和气孔关闭中不可或缺的作用提供了重要证据。