肿瘤内存在着高度的异质性，这种异质性表现在多个层面，比如肿瘤内既有致瘤细胞亚群，也有非致瘤细胞亚群；有空间异质性（相同肿瘤不同区域不同）与时间异质性（原发性肿瘤与继发性肿瘤不同）之分；肿瘤间异质性和肿瘤内异质性，也就是不同肿瘤的细胞之间的基因与表型不同以及相同肿瘤的不同细胞之间的基因与表型也不同^[1]。而肿瘤异质性的存在使得肿瘤的生长速度、侵袭能力、对药物的敏感性、预后等各方面产生差异。

图1 肿瘤的时空异质性^[1]

       尤其随着治疗的不断进行，药物压力以及肿瘤克隆演化会导致肿瘤内主克隆、亚克隆的不断变更，以及新的变异克隆的出现和发展，这就是肿瘤的时空异质性。

       为了克服癌症时空的异质性，更清楚肿瘤在治疗中的分子状态，可以在各个时间节点进行患者的肿瘤大量单细胞转录组测序，以获取全面的信息。

       利用Chromium^TM Single Cell 3’Solution技术，可为肿瘤研究人员提供群体肿瘤细胞基因表达信息，区分肿瘤亚群细胞异质性，可进行肿瘤微环境研究、肿瘤细胞分群、新类型细胞的发现以及肿瘤细胞亚群与正常组织细胞亚群的差异，从而进一步研究肿瘤细胞克隆进化机制及相关新生物标记的鉴定等，为肿瘤的精准治疗提供更为精细可靠的依据。

       翻阅高分的杂志和肿瘤的年会，发现多种肿瘤不同方向的研究都用到了群体单细胞测序。如：单细胞测序在黑色素瘤、胶质瘤、胃癌等肿瘤的研究，帮助我们发现肿瘤亚型的差异、肿瘤细胞发展变化周期的差异等。下面小编就2篇高水平文章做详细的解读，供各位科研达人参考。

Dissecting the multicellular ecosystem of metastaticmelanoma by

single-cell RNA-seq^[2]

期刊：《Science》 发表时间：2016.4 影响因子：37.205 发表单位：哈佛医学院

        如今在整个生物领域中正被用来研究一个共同的问题：如何研究异质细胞群体中的细胞多样性。这种多样性能够对细胞存活和增殖、对药物疗法和干预作出的反应以及很多其他的生物过程产生深刻影响。大规模单细胞转录组测序可用来研究黑色素瘤组织多样性的复杂细胞微环境。

➀ 通过流式分选了来自于19个患者的4,645细胞进行单细胞转录组测序；每个细胞15万Reads数。

➁ 荧光免疫组化分析。

➀ 单细胞转录谱区分恶性细胞和非恶性细胞的状态

        通过CNV分析确定为恶性的细胞，然后根据其基因表达情况进行了TSNE降维分析，恶性细胞分为6个亚型（图1），表明了肿瘤的异质性。而非恶性细胞则相反，主要是通过细胞类型进行了区分，比如T细胞、B细胞、巨噬细胞、内皮细胞、癌相关成纤维细胞（CAFs）和NK细胞（图2）。

图2 恶性细胞和非恶性细胞分群结果

➁ 恶性细胞的分析揭示了细胞周期的异质性

       我们使用G1或S／M期的标志性基因来分析恶性细胞的不同亚群（图3），该分析揭示了在肿瘤组织中，循环的细胞所占的比例平均为13.5%；也区分低循环状态的细胞和高循环状态的细胞，比如Mel79处于低循环、而Mel78则处于高循环状态的肿瘤。KDM5B基因的表达与非循环状态的肿瘤有高度相关性，它在小鼠模型中编码H3K4组蛋白去甲基酶，这个酶与低循环相关，同时也有类似于黑色素瘤干细胞的耐药性的特征。

图3 细胞所处循环状态展示图

➂ 非恶性细胞以及他们在黑色素瘤微环境中的相互作用

       各种各样的非恶性细胞组成了肿瘤的微环境，微环境的组成对肿瘤的发生和调节有重要影响。通过单细胞测序的数据区分了微环境中不同细胞的类型（图4），包括了T细胞、B细胞、巨噬细胞、内皮细胞和肿瘤相关的成纤维细胞（CAFs），并通过特征标签揭示了这些细胞在微环境中的相对丰富程度。

       接下来我们分析细胞在肿瘤微环境中的作用关系，有很多新的发现，比如一群在CAF细胞中特征表达的基因与T细胞的浸润有高度相关性（图4B）。

图4 大量黑色素瘤细胞之间的数据拆分解揭示了细胞与细胞间的相互作用

➃ 肿瘤浸润性T淋巴细胞的多样性及其功能状态

       肿瘤浸润淋巴细胞（TILs），尤其是CD8 + T细胞是免疫监视的主要决定因素。单细胞测序分析来推断各种类型T细胞的功能，从而有助于研究对免疫检查抑制剂的肿瘤反应和抵抗（图5）：

通过特征性标记定义了T细胞的主要亚群，比如CD4+,Tregs，CD8+等（图4A）。然后通过耗竭基因分析了细胞的耗竭状态，并通过免疫组化验证（图5B和5C）。

       最后分析了细胞毒T细胞中耗竭T细胞的特征表达状态，以及高耗竭和低耗竭细胞的基因表达情况（图5D、E、F），并进行了TCR分析（图5G和H）。

图5 T细胞耗竭特征基因的激活依赖和非激活依赖变异

       通过对黑色素瘤开展的大规模单细胞转录组测序，系统研究了肿瘤内的不同细胞亚群的组成、细胞亚群的功能以及肿瘤的微环境，为精准免疫治疗提供了参考。

Decouplinggenetics, lineages, and microenvironment in IDH-mutant

gliomas by single-cell RNA-seq^[3]

期刊：Science，2017.3 影响因子：37.205 发表单位：马萨诸塞州总医院、哈佛医学院

       肿瘤细胞的基因型和表达程序与细胞的表型、肿瘤微环境的作用、肿瘤的特质、演变和治疗抵抗有关。最近几年，肿瘤的基因组图谱之类的研究绘制了肿瘤的遗传景观、几千个肿瘤的表达形态、识别了驱动突变、并根据特定的转录图谱区分不同的亚型。但是肿瘤的遗传状态可以更为精确的进行研究，而整块组织的基因表达提供的信息是有限的，因为肿瘤程序的表达决定因素、微环境的影响以及肿瘤内基因的异质性都被整体平均了。而单细胞转录组测序可以解决这些问题，但是同时也带来了更多的花费和更多的工作量，比如需要更多的时间从新鲜的肿瘤样品当中获得单个细胞，尤其是一些罕见肿瘤。

       ➀ 10个IDH-A患者，流式分选肿瘤细胞，然后进行单细胞RNA-seq。6个IDH-O患者，流式分选肿瘤细胞，进行单细胞RNA-seq。

       ➁ 分析了从TCGA数据库下载的76个IDH-O91个IDH-A胶质瘤大量细胞的数据，有550个差异表达的基因。并对比了单细胞测序的结果与大量细胞测序的结果进行比较。

       ➂ DNA、RNA原位杂交。

➀ 分析IDH突变的胶质瘤标本单细胞RNA-Seq与大量细胞RNA-seq结果的差异基于细胞分群的方法：

1> 基因表达聚类分析，细胞分为胶质瘤细胞、免疫细胞和少突胶质细胞。

2> 由于胶质瘤细胞常伴有大的染色体变异，我们使用每个细胞在大的染色体区域基因表达的数据来评估CNVs，然后通过外显子测序和DNA FISH来验证CNV。使用基因表达和CNV来分类细胞的结果是一致的，一共定义了5097个恶性细胞。

接下来将单细胞测序的数据与ATCG下载的大量细胞RNA-seq的数据进行比较，寻找两种肿瘤亚群基因表达的差异，并分析亚群特征性基因（图6）。

图6 IDH-A和IDH-O因为肿瘤微环境和遗传学导致的基因表达的差异

       其中一半的基因在单细胞测序中没有差异，在大量细胞测序有差异，表明非恶性细胞导致的差异基因占了一半。免疫基因和神经基因作为非恶性细胞的基因就是一些干扰因素。

➁ IDH-A与IDH-O恶性细胞基因表达的差异主要源于基因组的问题。

基于转录组的结果主要是有4类基因组的变异引起的，分别是1p/19q、CIC激活的基因、CIC抑制的基因和P53的靶基因（图7）。

图7 不同肿瘤亚型的特征基因均有以上4类遗传学影响导致

➂ 单细胞测序显示IDH-A和IDH-O共享胶质细胞谱系

之前研究认为IDH-A和IDH-O分别以星状胶质细胞和少突胶质细胞为主。通过特征基因和PCA分析IDH-A和IDH-O胶质细胞的差异基因是很少的（图8），他们的区别主要是因为遗传学和肿瘤微环境的差异，而并不是胶质细胞的差异。

图8 IDH-A和IDH-O共享胶质细胞系

➃ 未分化的胶质瘤细胞与增值和干性相关

接下来分析了IDH-A和IDH-O中的未分化细胞，发现在2个亚群基因表达的高度相似性，均具有干性的功能，并通过荧光杂交进行验证（图9）。

图9 IDH-A和IDH-O的分化细胞主要是循环细胞和假定的干细胞

➄ 肿瘤微环境中胶质细胞和巨噬细胞的平衡

最后，我们采用PCA分析了小胶质细胞/巨噬细胞细胞的多样性，发现了胶质瘤中胶质细胞和巨噬细胞的表达程序，其中巨噬细胞的程序与肿瘤的临床分级和血管增加相关。肿瘤中的小胶质细胞/巨噬细胞转录程序具有连续性（而不是一个双峰分布），提示细胞状态的可塑性。并找到了肿瘤中浸润更多的小胶质细胞/巨噬细胞的特征基因（图10）。

图10 IDH-突变胶质瘤的胶质细胞和巨噬细胞的平衡

       我们通过单细胞转录组测序的方法分析了肿瘤细胞基因型、表型和微环境组成，重新定义人类的IDH突变的胶质瘤细胞组成（图11），为解释不同肿瘤表型的区别提供了一个通用的研究思路，其研究结果在疾病管理及治疗方面有重要参考价值。