准确灵敏的核酸检测在疾病评估中具有重要意义，尤其是在临床早期阶段。目前的核酸检测法以PCR方法为代表，具有较高的特异性和灵敏度，但同时也对专业设备和技术人员的要求较高，通常需要在实验室内进行。新冠大流行让人们意识到即时诊断的重要性，这就对核酸检测在速度和简便性上提出了更高的要求。

CRISPR/Cas系统原本是细菌免疫系统的组成部分，因其独特的反式切割活性可非特异性切割环境中的游离核酸，包括荧光报告分子，因而具备核酸检测的能力，并被开发为精准、快速、低成本和简便的分子检测工具，被称为下一代分子诊断技术。电化学发光(electrochemluminescence, ECL)是电化学和化学发光的结合，具有设备要求简单、 背景干扰低、 灵敏度高、 动态范围宽等优势，在生物分析和临床诊断中引起了越来越多的关注。近年来，CRISPR核酸检测技术也已从荧光信号检测迅速发展到与电化学检测联用，实现了靶标的精准识别和信号放大。但基于CRISPR的ECL传感器的应用受到了高背景干扰的限制，并且传统配合物的价格较昂贵、位阻较大，容易使检测的灵敏度降低，因此寻找高效、经济的ECL材料仍是十分必要的。 

江苏大学的Liu Pengfei团队在Biosensors and Bioelectronics期刊上发表了题为Cas12a-based electrochemiluminescence biosensor for target amplification-free DNA detection的论文，该研究构建了一种新的基于CRISPR/Cas12a的ECL生物传感器L-甲硫氨酸稳定金纳米团簇(Met-AuNCs)。A金纳米团簇是一种新兴的绿色纳米材料，具有优异的生物相容性和电化学特性，而Met-AuNCs作为高效ECL发射器实现ECL信号转换。用于HPV-16 DNA的免扩增检测。

01Met-AuNCs CRISPR系统的原理

Met-AuNCs CRISPR系统的工作原理如图1所示。 在电极表面修饰Met-AuNCs以获得原始信号。二铁标记的硫代单链DNA (SH-ssDNA-Fc)作为非特异性ssDNA随后被固定在Met-AuNCs表面以抑制其释放。当靶HPV-16 DNA存在时，Cas12a被激活并切割ssDNA，通过记录不同浓度靶HPV-16 DNA的ECL信号实现定量检测。

为了提高Met-AuNCs CRISPR系统的检测灵敏度，作者首先对TEA、SH-ssDNA-Fc、Cas12a/crRNA的浓度以及Cas12a在SH-ssDNA-Fc上的裂解时间等几个重要反应条件进行了优化（图2）。

在最佳反应条件下，作者随后采用一系列不同浓度的HPV-16 DNA加入Met-AuNCs CRISPR系统中。在室温下孵育10分钟以激活Cas12a的反式切割能力，再将经过修饰的电极用上述反应液处理，在ECL检测。如图3所示，作者观察到Met-AuNCs的ECL强度会随着HPV-16 DNA浓度的提高而持续增加，Met-AuNCs CRISPR系统检测HPV-16的检出限(LOD)可达到0.48 pM的水平（图3）。这一灵敏度要比目前已发表的几种CRISPR电化学检测系统的检测水平都要高（表1）。

03Met-AuNCs CRISPR检测系统的其它优势

 除灵敏度高以外，作者在Met-AuNCs CRISPR检测系统中采用HPV-18 DNA为干扰剂检测HPV-16 DNA(图4A)，测试结果表面该系统具有优异的特异性，这很大程度要归功于CRISPR/Cas12a系统自身优秀的识别能力；此外，在相同的实验条件下，作者还对不同浓度的靶标DNA进行5次平行测试(图4B)，测试结果表明Met-AuNCs CRISPR检测系统具有较高的重复性。

图4. Met-AuNCs CRISPR检测系统的特异性和重复性

 总结 

综上所述，作者提出了一种基于Met-AuNCs ECL材料的CRISPR/Cas12a检测系统，用于HPV-16 DNA检测。 得益于CRISPR/Cas12a系统的反式切割信号放大以及Met-AuNCs高效的ECL反应水平，该系统对目标HPV-16 DNA检测具有超高的灵敏度，并优于大多数的免扩增CRISPR技术。上述研究表明Met-AuNCs CRISPR检测系统在临床诊断中具有广阔的应用前景，并为即时检测提供了新方案。