一、贴壁细胞的传代所需材料

· 装有贴壁细胞的培养容器

· 经过组织培养处理的培养瓶、培养板或培养皿

· 完全生长培养基，预热至 37℃

· 一次性无菌15ml试管

· 37℃ 培养箱，充有二氧化碳浓度为 5% 的湿化空气

· 平衡盐溶液，例如：杜尔贝科磷酸盐缓冲液 (DPBS)，不含钙、镁和酚红

· 消化酶，例如：胰蛋白酶，不含酚红

二、贴壁细胞传代流程

细胞培养一定要保持工作区的无菌清洁，先用紫外灯和臭氧杀菌1h，然后通风30min，操作前需要换细胞间专用拖鞋，双手带上一次性橡胶手套并用75%乙醇消毒，穿上实验服，戴上一次性口罩和帽子，整个无菌操作都应该在酒精灯的周围进行。

1. 取对数生长期的贴壁细胞，弃掉旧培养基。

2. 用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞1-2遍。 (每10 cm2 培养表面积需要2 ml 溶液)。从与贴壁细胞层相对的容器一侧轻轻加入冲洗液，以避免搅动细胞层，前后摇晃容器数次。

注：冲洗步骤可去除可能抑制消化酶作用的少量血清、钙和镁。

3. 从培养容器中吸出冲洗液并丢弃。

4. 向培养瓶中加入预热的消化酶(例如：胰蛋白酶)；试剂量应足以覆盖细胞层 (每10 cm2 大约0.5ml)。轻轻摇晃容器，使试剂完全覆盖细胞层。

5. 将培养容器在室温下孵育约2分钟。

请注意，实际孵育时间根据所用细胞系不同可能有所差异。

6. 在显微镜下观察细胞解离情况。如果解离程度未达90%，可将孵育时间延长几分钟，每30秒钟检查一次解离情况。也可轻轻拍打培养容器以加快细胞解离。

7. 细胞解离程度大于等于90%时，倾斜培养容器，使细胞上液体尽快流尽。加入所用消化酶两倍体积的预热完全生长培养基。轻柔吹打细胞层表面数次，使细胞分散，成为单细胞悬液。

8. 将细胞转移到 15ml 离心管中，200g 离心5至10分钟。

请注意，离心速度和时间依细胞种类不同而有所差异。

9. 用最少体积的预热完全生长培养基重新悬浮细胞沉淀。

注：此时可进行细胞计数

10.将细胞悬液稀释到该细胞系推荐的接种密度，并将适量体积的细胞悬液转移到新的细胞培养容器中，把细胞放回培养箱。

注：如果使用培养瓶，将其放入培养箱前应将瓶盖旋松，以便进行充分的气体交换，除非您使用的是通气式培养瓶和透气性瓶盖。

三、悬浮细胞的传代

悬浮细胞传代比贴壁细胞传代稍微简单一些。由于细胞已经在生长培养基中悬浮，因此无需通过酶的作用使其从培养容器表面脱离，整个过程较为迅速，对细胞的损伤也较小。悬浮生长细胞的传代培养要比贴壁细胞简单得多，通常有两种方法。

1．直接给带传代的培养瓶中补充一定量的新鲜培养基，然后将进行分装。

2．先通过离心弃掉营养匮乏的旧培养基，然后再用适量的新鲜培养基重悬细胞沉淀，最后将其分装至培养瓶中即可。

悬浮细胞传代后的延滞期一般比贴壁细胞短。

四、所需材料

• 装有悬浮细胞的培养容器

• 完全生长培养基，预热至37℃

• 37℃培养箱，充有二氧化碳浓度为5%的湿化空气

五、悬浮细胞传代流程

所有与细胞接触的溶液和设备均应为无菌状态。必须采用正确的无菌技术，并且在超净台内进行。传代应在细胞处于对数期、未达到汇合状态时进行。达到汇合状态时，悬浮培养的细胞会聚集成团块，转动培养瓶时培养基会变得浑浊。传代前所建议的最大细胞密度随细胞系不同而有所差异；详细信息请参阅针对具体细胞的产品说明书或操作手册。

六、悬浮细胞的传代方法有2种

1、直接传代法：

①待悬浮细胞长满至80%-90%左右（细胞悬液变黄），即可传代；

②用吸管吸弃细胞悬液1/2～2/3；

③加入适量的新鲜培养基，继续培养。

2、离心传代法：

①将细胞悬液转移到离心管内；

②150g离心5min，弃上清；

③使用新鲜的培养基重悬细胞；

④吸管吸取适量细胞悬液，装入新的培养瓶，再加入适量的新鲜培养基，继续培养。