弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是最常见但侵袭性最强的B细胞淋巴瘤之一，大约40%的患者仍然无法治愈。本研究使用单细胞测序（scRNA-seq）技术成功绘制了弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）的单细胞转录组图谱，揭示了DLBCL病例内部、病例之间的表型异质性。还首次揭示了DLBCL肿瘤细胞与微环境细胞的互作网络，并进一步验证了HBV感染对肿瘤细胞生存及免疫逃逸方面的影响，深入地解析了DLBCL的生物学特点，也为DLBCL免疫治疗方面提供了新的启示。

scRNA-seq

对17例DLBCL（HBV+×7，EBV+×2，HBV-EBV-×8），1例滤泡性淋巴瘤FL（HBV-EBV-），Burkitt’s淋巴瘤BL（HBV+），1例淋巴组织增生RLH（HBV+）共20个样本进行scRNA-seq，对DLBCL恶性细胞和良性细胞绘制综合细胞图谱，再对肿瘤微环境中恶性B细胞、T细胞、骨髓细胞进行深入分析。

1.DLBCL单细胞图谱揭示恶性B细胞的肿瘤间异质性

对来源于17个DLBCL 和3个对照样本的 94,324个细胞进行单细胞RNA测序（图1A），利用标记基因区分出B细胞（54%）、T细胞（41%）、髓系细胞（2.8%）、NK细胞（0.8%）、成纤维细胞（0.4%）、内皮细胞（0.4%），并采用拷贝数变异（copy number variation, CNV）成功将恶性B细胞（46.5%）与正常B细胞（7.5%）区分开来（图1B、1C）。随后在每种主要细胞类型（>所有细胞的1%）内进行重新聚集，总共鉴定出23个恶性细胞亚群和29个非恶性细胞亚群（图1D）。在恶性B和T细胞亚群中发现了更多的细胞，并且每个细胞表达的基因数量与恶性B细胞亚群相关（图1E）。此外，恶性B细胞具有高度的患者特异性，而不同个体的非恶性细胞具有相似的基因表达谱（图1F）。针对来源于每一个患者的恶性B细胞进一步分析，每个DLBCL样本的恶性细胞中发现了一组独特的高表达基因，采用非负矩阵分解（NMF），共鉴定出73不同的基因表达特征，最终定义了8个常见表达特征，这也提示了DLBCL在不同患者之间以及肿瘤内部存在高度异质性（图1G）。

2. HBV⁺患者肿瘤细胞中MHC-II表达特征基因的高表达

为估计在恶性B细胞中发现的任何共享表特征是否与HBV感染相关，对 HBV+和 HBV- EBV-组的样本之间的表达评分进行了比较，只有 MHC II 表达特征的表达评分在 HBV+ 组中显着较高（图2A）。此外，属于MHC II表达特征的9个基因在每一个HBV+患者的恶性细胞中显着高于HBV-EBV-组。随后对HBV+和HBV- EBV-恶性细胞之间的基因表达谱进行了直接比较，MHC II表达特征的基因确实是HBV+恶性B细胞中差异表达的基因之一（图2B）。紧接着比较了DL05和DL13两个样本诊断和复发的恶性细胞，在复发样本DL13中，从恶性细胞中提取了7个基因表达特征，其中6个特征与DL05中鉴定的特征重叠（图2C）。值得注意的是，MAPK特征只在DL13中表达。随后对DL05和DL13的恶性B细胞进拟时序分析，总共确定了2个分支点和5个状态（图2I），通过关注疾病复发的机制，在轨迹的分支点 2 处进行分支分析，鉴定出一组在状态5下高表达的基因，包括几个MAPK信号相关基因，这可能与DLBCL患者的复发有关（图2K）。

3. 非恶性B细胞亚群细分

针对非恶性B细胞进行重新聚类，细分得到5个Naive B亚群和3个Memory B细胞亚群（图3A-3C）。随后鉴定了每个亚簇中差异和高表达的基因，并将其聚类为7个基因集（图3D-3E）。HBV+ 组中富集的Bmemory-1似乎与HBx刺激有关，并可能与病毒复制有（图3G）。同样有趣的是，在 HBV+ 样本中发现了表达EGR2和表达EGR3的恶性B细胞，这表明来自HBV+患者的DLBCL样本中的恶性细胞亚群也可能与HBx刺激相关（图3H）。EBV+ DLBCL样本中的B细胞 Bmemory-3 亚群可能与EBV感染有关。对浸润性非恶性B细胞进行轨迹分析，确定了2个主要轨迹，并在轨迹的分支点1处进一步进行分支分析，鉴定出富含多种途径的基因，推测它们可能决定HBV相关的细胞命运（图3I-3L）。

4. T细胞亚群细分

对T细胞进行重新聚类，得到CD4+T细胞、CD8+T细胞共16个亚群，根据之前的研究最终划分为5个分类，分别为初始T细胞、细胞毒性T细胞、调节性T细胞 （Treg）、T （Tfh） 、 T 17 （Th17）（图4A-4C）。对于细胞毒性 CD8+ T细胞，细胞毒性标记物的表达水平与共抑制受体的表达水平高度相关，表明这些 T 细胞中可能存在激活依赖性耗竭表达程序（图4D）。通过比较平均细胞毒性和耗竭分数，发现两个细胞毒性亚簇 CD8cyto-4 和 CD8cyto-6 比其他细胞毒性亚簇具有更强的耗竭状态（图4E）。所有T细胞亚簇均由来自三个或更多样本的细胞组成（图4F）。随后鉴定了每个亚群的差异和高表达基因，并将其聚类为 14 个基因集（图4G）。在 HBV+ 和HBV-EBV- 组之间未观察到每个样本的T细胞亚群百分比存在显着差异（图4H）。对CD8+T细胞和CD4+T细胞分别进行轨迹分析，都确定了2条主要轨迹，其中CD8+T细胞两条主要轨迹细胞毒性和耗竭分数都很高（图4I-4J）。

5. 骨髓细胞亚群细分

针对髓细胞进行重新聚类，得到3个巨噬细胞亚群（MP）、2个传统DC亚群（cDC）、一个浆细胞样DC（pDC）亚群共6个脊髓细胞亚群（图5A-5C）。其中cDC-c1亚群高表达CLEC9A，pDC亚群高表达CLEC4C，cDC-c2亚群高表达LAMP3的同时还高表达CD274，表明 DC 亚群对T细胞具有潜在的抑制作用（图5E-5J）。HBV+和HBV-EBV-组之间DC亚群的比例没有观察到显着差异，有趣的是，cDC-c2亚群主要与DLBCL的ABC亚型相关（图5C）。结合巨噬细胞的体外功能表型M1和M2分析，结果显示MP-c1与促炎M1特征密切相关，MP-c2与抗炎M2特征和吞噬作用特征相关，MP-c3与M2和血管生成特征的高表达相关（图5F）。另外，对HBV+患者的DLBCL样本中观察到MP-c2 的百分比显着较高（图5G），还对 MP-c2 中的巨噬细胞与其他亚群中的巨噬细胞之间的基因表达进行了比较，确定了MP-c2 中优先表达的 11 个基因（图5H）。

6. 肿瘤微环境中亚群间的调控关系

为了解细胞亚群之间的调控关系，研究免疫相关的配体-受体对相互作用，结果显示骨髓细胞亚群拥有最多数量的配体，而细胞毒性 CD8+ T 细胞亚群拥有最多数量的受体（图6A，最能预测抗原呈递细胞和T细胞之间的调节轴（图6B）。重点关注与恶性细胞的相互作用，例如，CD40LG-CD40可能促进HBV+ 组DLBCL中恶性细胞与初始CD4+T细胞之间更强的相互作用（图6C-6E）。此外，CD4+ Tfh和恶性细胞之间通过BAFF介导的信号传导存在暗示性相互作用，并且这些相互作用仅在 HBV+ 患者中观察到（图6D）。DLBCL的另一个值得注意的发现是预测恶性细胞和 CD8+毒性细胞以及Tregs之间的CD70-CD27 相互作用，这可能进一步导致T细胞耗竭和抑制（图6F-图G）。

参考文献：

Ye X, Wang L, Nie M, Wang Y, Dong S, Ren W, Li G, Li ZM, Wu K, Pan-Hammarström Q. A single-cell atlas of diffuse large B cell lymphoma. Cell Rep. 2022 Apr 19;39（3）:110713. doi: 10.1016/j.celrep.2022.110713. PMID: 35443163.