采用大规模泛素化分析技术探索水稻叶片中的泛素化位点

—— 泛素化肽段富集+高精度质谱系统

Comparative Profiling of the Rice Ubiquitome Reveals the Significance of Lysine Ubiquitination in Young Leaves. J Proteome Res. 2015; 14(5): 2017-25.

蛋白质泛素化是一种广泛存在的蛋白质翻译后修饰形态，对真核生物的生长发育、细胞凋亡、环境应答以及其他很多重要的生物学过程具有显著的调控作用。尽管水稻中已经有少数几个泛素化蛋白质被发现，但是因为技术手段的限制，大规模的泛素化位点及泛素化程度的分析研究则尚未见报道。

本次研究结合高灵敏免疫亲和富集技术以及高精度质谱系统首次对水稻进行了大规模泛素化位点分析，在水稻叶片中发现了来自464个蛋白质的861个含di-Gly-Lys 结构的泛素化位点。生物信息学分析发现，这些泛素化蛋白质在细胞内具有不同的亚细胞定位，以及多种类型的功能，主要与binding 以及 catalytic activity相关，同时还发现这些泛素化位点可以归结为7个保守的motif。蛋白质互作网络和KEGG分析显示泛素化可以广泛调节水稻中的信号通路和代谢通路。本次研究证明了大规模泛素化分析技术（泛素化肽段富集+高精度质谱系统）可以有效地对植物的泛素化状态进行大规模的分析。同时该研究发现了464个泛素化蛋白质，为进一步研究这些泛素化蛋白质在水稻体内的生物学功能奠定了基础。

Figure 1. Schematic diagram of a strategy for the global identification of ubiquitinated peptides in rice.

泛素是76个氨基酸大小的蛋白质，泛素化修饰可以以多种形式存在，泛素化修饰结构和修饰位点都非常复杂。在蛋白质的酶解过程中，经Trypsin酶解后泛素分子会被切除而在被修饰的Lys上留下两个Gly，从而形成di-Gly-Lys的结构。针对该结构可采用相应的抗体特异性富集被泛素化的肽段，再结合高精度质谱系统即可对被富集下来的泛素化肽段进行定性和定量分析。本研究即采用该技术路线对水稻幼苗叶片进行了大规模泛素化分析。

本研究共找到了464个泛素化蛋白质中的861泛素化位点。

GO功能注释：发现这些泛素化蛋白质在细胞内具有多种多样的细胞定位，并且与广泛的生物学过程密切相关。从分子功能角度出发，尽管发现这些泛素化蛋白质与多种分子功能相关，但绝大部分确与binding（229个蛋白质） 以及 catalytic activity（196个蛋白质）相关。

Figure 2. Gene ontology functional characterization of the identified ubiquitinated proteins. (A) Distribution of the ubiquitinated proteins in terms of biological processes. (B) Distribution of the ubiquitinated proteins in terms ofmolecular functions. (C) Distribution of the ubiquitinated proteins in terms of cellular components.

Motif分析：有关人类的研究发现泛素化位点并不会像磷酸化位点一样具有比较保守的motif，但对水稻中的这些泛素化位点进行motif进行分析，发现这些位点可以归结为七个可能的motif，分别为AAXXXXKub, AXXXXXKubXA, AXXXKub, AKub, EKub, KubXXA, and AXKub，这也说明植物与动物的泛素化位点结构存在一定的差异。

Figure 3. Ubiquitinated lysine motifs in rice. (A) Ubiquitination motifs and the conservation of ubiquitination sites. The height of each letter corresponds to the frequency of that amino acid residue in that position. The central K refers to the ubiquitinated lysine. (B) The number of identified peptides containing ubiquitinated lysine in each motif.

蛋白质互作网络分析：发现水稻中的泛素化蛋白质可影响钙调节过程，并与14-3-3家族蛋白质有密切联系。

Figure 4. Interaction networks of ubiquitinated proteins associated with calcium sensors (A) and 14-3-3 proteins (B,C). Ubiquitinated proteins are highlighted in yellow.

KEGG通路注释：显示464个泛素化蛋白质中的有234个与195个代谢通路相关，其中比较主要的有glycolysis/gluconeogenesis、photosynthesis等途径，说明泛素化对调节水稻的生长发育具有十分显著的作用。

Figure 5. Ubiquitinated proteins in representative metabolic pathways in terms of glycolysis/gluconeogenesis in the rice cultivar Nipponbare. Ubiquitinated proteins are highlighted in green.

本研究首次利用免疫亲和富集技术结合高精度质谱系统的路线在水稻中进行大规模泛素化位点分析，不仅证明该技术路线在植物中同样适用，也发现了水稻中的大量泛素化蛋白质和泛素化位点，为水稻体内的泛素化状态研究积累了大量的数据，也为水稻体内泛素化蛋白质的生物学功能研究奠定了基础。

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