单细胞全基因组测序——求同存异，追本溯源
细胞是生命体结构和功能的基本单位，人类对生命本源的不断探索推动了科学技术的发展。单细胞全基因组测序是在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项新技术，它对单个细胞异质性的研究不仅在表观遗传学、植物学、微生物学等理论研究中发挥重要作用，在癌症肿瘤疾病诊断治疗、胚胎植入前遗传诊断筛查等临床应用中也有非常重要的意义。
2011年，《Nature Methods》将单细胞测序列为年度值得期待的技术之一；2013年，《Science》将单细胞测序列为年度最值得关注的六大领域榜首。近年来单细胞全基因测序不断发展的技术方法和在各领域的研究成果也屡屡登上“NCS”的荣誉殿堂。仿佛一夜之间，单细胞全基因组检测技术就成了生物医药研究人员的新宠。
究其原因，除了技术层面的进步，单细胞全基因组测序也体现了科学研究对生命体极大的尊重。下面我们就从几个方面来解读这项新兴技术。
一、 单细胞全基因组测序技术为什么会兴起？
单细胞全基因组测序的出现并非偶然，而是科学发展到一定阶段的必然结果。伴随着基因测序技术水平的提高以及千人基因组计划、癌症基因组计划、人类肠道宏基因组计划等重大国际合作项目的相继开展，基因组研究日益兴旺。然而，无论是基因芯片或者二代基因测序技术（NGS）都需要从超过数百万个细胞中提取DNA或者RNA，得到的信息自然就来自于多个细胞。虽然从宏观角度有一定的统计学意义，然而从精准生物医学的角度来看，这种类似于大锅饭的平均主义的研究方法存在明显的局限性。此外，对于不易培养的临床稀有样品，例如肿瘤循环细胞、早期发育的胚胎细胞等，其量不足以进行基因组的分析，也给基因分析造成了难题。
单细胞全基因组测序技术的应运而生解决了用组织样本测序难以解决的细胞异质性难题，为解析单个细胞的行为、机制及其与机体的关系等提供了新方法。这种方法能够得到单个细胞30亿碱基的全基因组序列信息，并且可以对逐个细胞进行序列比较，真正做到求同存异，追本溯源。
二、 单细胞全基因组测序技术都有哪些难点？
第一，是单细胞的获取；第二，单细胞基因组的多重扩增；第三，就是高通量测序。
单细胞的获取，最初是通过梯度稀释的方法，既繁琐也容易污染；随后通过显微操作方法，用类似注射器的装置分离单细胞，或激光捕获显微切割技术（LCM），然而可操作性并不强；再往后，流式细胞仪的分拣成为最常用的单细胞分离方法，但对环境要求过高；近年来微流控技术的发明，可以实现单细胞分拣和多重扩增一步完成，逐步成为研究者们的选择。
单细胞基因组的多重扩增技术最常用的有：简并寡核苷酸引物PCR扩增（DOP-PCR）、多重置换扩增反应（MDA）、置换预扩增和PCR扩增的组合（MALBAC）三种技术，各有优缺点。这些扩增方法可以把单细胞中pg级甚至fg级的DNA扩增至可满足测序的μg级样品量，正是这些技术的发明才使单细胞基因组测序成为可能。
高通量测序关键在于仪器，比如Illumina的HiSeq、Fluidigm的C1，而更多情况下，我们通常选择高通量测序平台来进行测序服务，比如华大基因、安诺优达等企业平台。
三、 各种基因组扩增技术的优缺点是什么？
针对三种基因扩增技术，市面上已有一些比较成熟的产品，其优缺点主要表现在扩增结果的均一性、覆盖率、重复性、扩增偏倚性等方面的差别。当然还需根据具体的实验目的有针对性地选择产品，成本也是要考虑的一点。
其中DOP-PCR方法是最为常用和经典的一种扩增法，以Sigma的GenomePlex® Single Cell Whole Genome Amplification Kit（WG4）为例，该技术基于基因组DNA随机片段化的原理，所得的小片段转化为两侧含有通用引物位点的PCR扩增文库分子。WGA通过通用随机寡核苷酸引物进行的文库分子PCR扩增实现，在4小时内即可获得5 - 10 μg 高丰度完整的基因组DNA，最大限度降低等位基因偏倚。（Sigma还有针对二代测序的WGA、WTA的产品）
单细胞全基因组扩增产品优势分析
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品牌 |
技术方法 |
优势 | |
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Sigma |
简并寡核苷酸引物PCR扩增 |
均一性更高、重复性更高、覆盖度较低，成本低。应用于凝胶电泳、qPCR、CGH微阵列、STR分析、SNP分析等研究。 | |
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The Ampli1™ Whole Genome Amplification (WGA) kit |
Silicon Biosystems | ||
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PicoPLEX Single Cell WGA Kit |
NEB | ||
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REPLI-g Single Cell Kit |
Qiagen |
多重置换扩增（MDA） |
基因组覆盖度高、重复性较低、扩增不均匀、成本低。应用于NGS、CGH微阵列、qPCR分析等，适合做SNP或mutation的研究。 |
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Illustra Single Cell GenomiPhi DNA Amplification Kit |
GE | ||
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TruePrime™ Single Cell WGA Kits |
Sygnis | ||
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MALBAC Single Cell WGA Re-Amp Kit |
亿康基因 |
置换预扩增和PCR扩增的组合（MALBAC） |
扩增的均一性、覆盖度高、重复性高、成本高。应用于qPCR、CGH array、SNP array、Sanger测序和高通量测序等。 |
MDA是一种等温的链置换扩增反应，使用随机的6碱基引物在多位点和模板链结合， 接着利用phi29DNA聚合酶的强模板结合与置换能力实现对全基因组的扩增。MALBAC通过形成闭合环来抑制DN**段被重复地复制，以保持DNA扩增的均匀性，解决了传统方法对单细胞基因组扩增的强烈偏好性的问题。该技术由哈佛大学谢晓亮教授团队在2012年发明。
四、 单细胞基因组测序目前应用于哪些领域？
自单细胞基因组测序技术兴起以来，已有大量成果发表在“NCS”等国际著名学术期刊上，该技术不仅被应用在单细胞基因组学研究、细胞异质性研究、微生物单细胞测序、植物学研究等理论研究中，还在基于循环肿瘤细胞（CTC）的癌症无创诊断研究和基于胚胎植入前筛查诊断的（PGS、PGD）的辅助生殖研究中发挥重要作用。当然肯定还有许多研究方向和成果是我们未知的，下图例举了该技术在各领域取得的部分重要研究成果。
自单细胞基因组测序技术兴起以来，已有大量成果发表在“NCS”等国际著名学术期刊上，该技术不仅被应用在单细胞基因组学研究、细胞异质性研究、微生物单细胞测序、植物学研究等理论研究中，还在基于循环肿瘤细胞（CTC）的癌症无创诊断研究和基于胚胎植入前筛查诊断的（PGS、PGD）的辅助生殖研究中发挥重要作用。当然肯定还有许多研究方向和成果是我们未知的，下图例举了该技术在各领域取得的部分重要研究成果。
五、 单细胞基因组测序技术未来的发展如何？
单细胞全基因测序技术目前还处于初级阶段，在技术上仍有许多难点丞待解决，例如：如何高效地分离单细胞，如何确保全基因组完整、均一、无偏差的扩增，以及如何保证基因组测序及数据分析的准确性等。近年来各大生物医药巨头都将战略聚焦在该技术上，2016年初Illumina携手Bio-Rad进军单细胞测序，研发新的单细胞测序流程；CAR-T治疗巨头Juno收购AbVitro（单个T细胞和B细胞进行基因测序），意图在癌症免疫疗法中再创辉煌；10X Genomics推出单细胞测序新设备，已开始接受预定。这些重磅消息无疑表明单细胞基因组测序将引领新一代测序技术的潮流。
回到本文的开头，细胞是生命体结构和功能的基本单位，只有真正认识了解每一个细胞，才能在理论研究中做到真实客观，才能在临床疾病诊断和治疗时准确无误。未来，日益更新的测序技术和不断拓宽的研究方向会带领我们从单细胞层面更加精准的理解生命体，进而发现生命的真谛。