请看如何运用蛋白质组学研究的经典套路“相对定量蛋白质组（筛选）+绝对定量蛋白质组学（验证）”，在转化医学顶尖杂志“Theranostics”上玩出不一样的火花！
■ 文章标题
■ 作者及课题组介绍
本文第一作者为上海交通大学薛婷博士，薛婷博士在蛋白组学领域有着丰富经验，擅长疾病蛋白组学研究。
本文第一作者课题组为上海交通大学生物医学工程学院生物传热传质实验室徐学敏课题组及系统生物医学研究院系统生物医学教育部重点实验室严威课题组。
■ 研究背景
转移性乳腺癌是威胁全球女性生命健康的头号杀手，治愈率低。徐学敏课题组多年来致力于治疗转移性乳腺癌新方法的研究，自主研发了“冷热交替治疗系统”，该系统在转移性乳腺癌的治疗上展现出了良好的治疗效果。
该系统不仅能杀灭原位肿瘤，而且能有效抑制远端转移，激发强而持久的抗肿瘤免疫效应，有效提升小鼠长期生存率（>60%）。
为更好地探索该系统在激发机体抗肿瘤免疫效应的机制，徐学敏课题组联合严威课题组，应用高通量的蛋白组学技术，在大规模样品上对血清糖蛋白质组展开研究。
■ 研究过程及结果
研究运用经典的差异蛋白质组学研究方法iTRAQ联合近来兴起的绝对定量蛋白质组学研究方法PRM这两种技术，在基于Orbitrap的质谱平台上，获得了高质量、高可信度的数据，为解析冷热交替治疗引发的抗肿瘤免疫机制奠定了良好基础。
图1. 处理与未处理小鼠的血清糖蛋白多组定量蛋白质组学分析
套路第一步
相对定量蛋白质组（筛选）
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研究人员采集了冷热交替治疗后8个时间点的小鼠血清，通过富集血清中糖蛋白，利用iTRAQ标记和off-gel分离，比较治疗与非治疗小鼠在相同时间点下糖蛋白谱的变化。
研究人员共鉴定到308个糖蛋白，其中231个糖蛋白被定量，53个糖蛋白被定义为差异蛋白。研究人员发现冷热交替治疗引发的生物学响应具有时间特征，而急性应激响应是其率先引发的生物学事件，提示其在抗肿瘤效应中的作用。
图2. 蛋白质组随时间进程的定量变化
套路第二步
绝对定量蛋白质组（验证）
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随后，研究人进一步挑选了23个差异糖蛋白，利用高灵敏度、高选择性的PRM 靶向蛋白组学技术，对其在8个时间点上的表达展开了靶向验证，该验证共涉及94份（体现了质谱高通量的优势）小鼠血清样品。
研究发现，冷热交替治疗激发了机体快速、强烈的急性应激响应，伴随着一系列急性应激蛋白短时间内高水平的表达，扭转了机体内肿瘤介导的慢性炎症环境，打破了Th2型的肿瘤免疫抑制生态圈。急性应答微环境激发DC细胞成熟、Th1型记忆型细胞增殖，诱导机体产生Th1型抗肿瘤免疫效应，最终消退原位肿瘤，有效抑制远端肿瘤的形成和发展。基于靶向验证的蛋白组学研究能够进一步帮助研究者从系统性的角度了解冷热交替治疗所诱导的生物学效应。
图3. 使用平行反应监测 (PRM) 技术对急性应激响应和白细胞活性相关蛋白绘制时间变化曲线，验证蛋白变化
■ 研究总结
本研究利用相对定量蛋白质组学方法（iTRAQ，当然也可以有TMT、label-free等），从整体上描绘了治疗后血清糖蛋白组的变化；并联合运用绝对定量蛋白质组学技术PRM ，对目标蛋白进行了靶向验证和研究。
PRM的验证结果与 shotgun 有较好的可关联性，其更强的灵敏度及选择性，能够提供更好的定量信息。相比传统的依赖抗体验证的手法 (WB，ELISA)，PRM在通量、效率、成本以及适用范围上，有明显的优势。
相对定量蛋白质组学和绝对蛋白质组学技术联合应用已成为蛋白质组学研究的金标准，在复杂临床样本（血清、组织、穿刺、石蜡包埋）及翻译后修饰相关研究中具有无可匹敌的优势，是转化医学和精准医学研究的必备武器。
本文转自Orbitrap组学俱乐部，稍作修改，如有问题，请随时与我们联系。
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