2013年，Broad研究所的张峰和Eric S. Lander两个研究团队，同时在Science中发表了CRISPR-Cas9的文库应用，首次把这项技术暴露在了公众视野中。随着科研软实力和CRISPR-Cas9体系开放性的不断增加，在2017年后文库筛选已经成为了一种主要的差异基因发掘工具。但是目前仍然有很多人不知道文库的具体的实验方式及应用场景。
2022年3月25日，Julia Joung等人在Nature Communications发表“CRISPR activation screen identifies BCL-2 proteins and B3GNT2 as drivers of cancer resistance to T cell-mediated cytotoxicity”，文中借助CRISPR-Cas9文库筛选技术开展肿瘤研究。本文以此为例，分析CRISPR-Cas9文库的研究思路。
1 技术思路
（1）通过CRISPR-Cas9激活文库确定恶性黑色素瘤细胞A375中与免疫耐受相关的相关基因，并通过MAGeCK与现有转录组数据和TCGA数据库结果分析后，确定4个候选基因，为CD274、MCL1、JUNB、B3GNT2。（差异基因筛选）
（2）首先，分别构建CD274、MCL1、JUNB、B3GNT2 4个基因的过表达细胞株。然后在体外，通过CTG法（CellTiter-Glo）检测NY-ESO-1 CAR-T细胞对4株过表达细胞及对照细胞的杀伤能力差异。在体内，使用NGS小鼠皮下移植瘤模型，证明4株过表达细胞及对照细胞对于尾静脉过继NY-ESO-1 CAR-T细胞的响应性差异。（基因表型验证）
（3）通过Caspase-8活性检测、流式检测、CHIP-seq及RNA-seq等方法，证明MCL1和JUNB基因通过影响线粒体凋亡信号通路去抵抗FasL和TRAIL诱导的细胞死亡。（机制证明）
（4）通过细胞因子分泌检测及COIP等实验证明B3GNT2基因主要通过影响肿瘤细胞与T细胞的受体配体结合发挥免疫耐受功能。（机制证明）
（5）构建4个差异基因敲低肿瘤细胞株，反向验证是否有免疫增敏效果。同时用小分子抑制剂证明基因正确性。（多向验证）
2 研究内容
作者通过首先制备CRISPR-Cas9激活文库，然后构建NY-ESO-1抗原高表达的文库细胞株，继而与NY-ESO-1的CAR-T细胞进行共培养，通过瞬时杀伤和长效杀伤的两种筛选方式进行筛选，将筛选后的样本通过CRISPR-Screen进行差异基因初步筛选。在筛选好的差异基因与公共数据库中的数据进行比对后，确定明显差异表达的CD274、MCL1、JUNB、B3GNT2 4个基因进行后续研究。
TIP1：好的开始是成功的一半啊，集美们，一定要用新颖的技术，结合已有的公共数据库数据进行联合的基因发掘工作啊。
基于表达NY-ESO-1抗原的人黑色素瘤细胞A375构建CD274、MCL1、JUNB、B3GNT2基因过表达肿瘤细胞，在体外与NY-ESO-1 CAR-T细胞共培养，后用CTG法检测各个过表达细胞株与对照细胞株的存活细胞之差，证明4个基因过表达后会降低CAR-T细胞的杀伤活力。
步骤2中的过表达和对照构建NGS小鼠，皮下肿瘤模型，成瘤后尾静脉过继CAR-T细胞，实验证明，过表达肿瘤对CAR-T细胞的治疗响应性更差，小鼠生存期更短。
已有研究表明，JUNB是一种转录因子，并且能够影响NKG2D配体，从而影响NK细胞的正常杀伤功能，而MCL1更是在早期的研究中就发现与FASL和TRAIL受体功能相关，因此作者也受其思路启发，从受体方面入手验证。过表达和对照用流式检测FASL和TRAIL受体的表达量，确定过表达JUNB和MCL1后，会影响受体表达；JUNB和MCL1过表达细胞用 FasL 或TRAIL处理后，检测Caspase-8的活性，发现JUNB的作用会被扭转，因此也确认JUNB是通路下游非常重要的一环；随后通过CHIP-seq和RNA-seq两种技术，证明JUNB直接调控的基因是NFKB，并且能够通过操控NFKB来影响下游信号通路的转导，至此，完美解释了JUNB基因影响免疫耐受的环路，而MCL1并不影响前端的受体表达，因此作者证明它是直接调控了线粒体凋亡相关的BAX和BAK发挥功能。
TIP2：再次证明，多读文章有多重要啊集美们，不要光是天天买买买，一定要看文献啊，当我们的实验有了系统的理论基础和支持，才有了攀登高分文章阶梯的登山杖。
至于B3GNT2基因，目前已知它可以编码β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶 ，因此作者合理推测此基因影响多聚乳糖胺合成，并且目前已经有其他研究结果隐约指明了这一证据。作者在补充实验中已经通过番茄凝集素检测实验证实B3GNT2过表达细胞胞内和胞外中多聚乳糖胺含量都有所增加，而这一现象，是由于B3GNT2诱导的N-糖基化修饰和O-糖基化修饰有关。作者以此作为起点，通过细胞因子分泌实验和CTG细胞活力证明，在传统的共培养体系中，持续加入N-糖基化修饰抑制剂KIF，能够扭转B3GNT2过表达带来的免疫耐受；通过COIP实验B3GNT2过表达之后番茄凝集素对于各类肿瘤细胞表面受体结合能力大幅提升，这也支持了作者的假说。
最后当然多项验证了，首先作者先在表达HER2抗原的SW1417细胞中敲低CD274、MCL1、JUNB、B3GNT2 这4个基因，然后通过与HER2 CAR-T细胞共培养验证基因的有效性和广泛性，后续在多种肿瘤细胞中证实N糖基化修饰抑制剂KIF和MCL1小分子抑制剂S63845的功能，从另一角度证明了基因功能，并且为临床应用打开思路。
TIP3：强调一点，对于肿瘤研究来说，尽量一定要回归临床，当我们的研究有了一定的临床指导意义，我们才好发文章啊。
综上所述，这篇文章系统的向我们展示了，如何用CRISPR-Cas9文库发掘差异基因及后续实验验证的全套过程。文章涵盖了文库筛选及肿瘤免疫两个领域内研究热点，在选题方面可以说是羚羊挂角，不负高分期刊之名，值得我们深入学习和参考。