实验背景：

CRISPR/Cas9基因敲除系统因为其构建方便，设计灵活，成为基因敲除及敲入的新一代利器。该系统由有DNA切割活性Cas9蛋白及识别特异靶点的gRNA组成，由于只需对系统中的gRNA进行编辑就能实现靶点识别，极大了简化了构建基因敲除载体的工作。该系统中的Cas9蛋白大小为160kd，编码基因长达4kb，如何将Cas9基因有效地转染细胞成为制约该系统应用的瓶颈。

为此我们设计构建了Cas9蛋白的慢病毒表达载体，利用慢病毒的高效转染和稳定表达特点，构建稳定表达Cas9蛋白的稳转细胞株。后续实验中只需要导入小分子gRNA就能实现基因敲除。小分子gRNA可以直接转染化学合成的gRNA、gRNA表达质粒等方法转入。据我们观察，采用慢病毒Cas9稳转细胞株+gRNA转染的方法可以显著提高基因敲除效率。

实验路线：

包装表达Cas9蛋白的慢病毒→Cas9慢病毒感染目的细胞→稳转细胞系筛选→基因组检测Cas9整合→Cas9功能验证

一、试剂

1. 细胞培养基及其他细胞培养所需试剂。
2. 转染辅助试剂Polybrene（用水配制为6mg/ml，-20℃冻存）。
3. Cas9表达慢病毒（制备方法见Cas9慢病毒包装实验）。
4. 嘌呤霉素或者G418。

二、Cas9慢病毒包装

（一）、试剂准备 

1、Cas9过表达慢病毒载体选择。

我们现提供4种表达Cas9 蛋白的慢病毒载体，您可以根据抗生素要求和基因敲除实验设计进行选择。
1）抗生素选择：Puromycin或G418
用嘌呤霉素筛选比较快，仅需4-7天即筛选出阳性细胞。G418筛选需要7-14天左右。此外不同的细胞对抗生素的敏感度差别很大。最好在开始实验前对细胞进行抗生素敏感度测试，以选择合适的抗生素种类，确定筛选浓度。 
2）Cas9蛋白选择：Cas9和Cas9Nicknase
Cas9蛋白切割DNA双链。Cas9Nicknase是Cas9蛋白的D10A突变体，切割DNA单链。由于DNA上的Nick缺口会很快被细胞修复，一般不会造成基因突变。Cas9Nicknase需要成对的gRNA辅助才能实现DNA双链断裂。 
采用Nicknase蛋白可以提高基因敲除的特异性，但是对gRNA的设计要求较高。敲除效率也比Cas9蛋白低一些。 
简单地说，Cas9基因敲除效率更高，操作更容易；Cas9Nicknase特异性更高。您可以根据实验设计需要进行选择。

2、慢病毒包装载体：Cas9慢病毒表达载体采用3质粒慢病毒系统。您可使用我公司的pH1、pH2；addgene载体psPAX2、pMD2.G或者pCMV-dR8.2 dvpr、pCMV-VSVG均可包装成功。

3、无内毒素质粒提取试剂盒。使用质量可靠的质粒提取试剂盒可以提供更高的转染效率和病毒包装效率。我们采用Qiagen的Plasmid Plus系列产品可以取得满意的包装效果。

4、转染试剂（可使用我公司转染试剂Polyfect-V或您的实验室中现有转染试剂）。

5、病毒包装细胞：我公司的293V、HEK293或者HEK293T均可使用。需要注意的是包装细胞状态对于病毒产量很重要。细胞聚团、贴壁不牢、生长缓慢等均是细胞老化的表现，这样的293细胞是不能使用的。

6、慢病毒纯化试剂盒（可用我们的PEG纯化产品，货号P1201；或者其他公司的商品化试剂盒；推荐用超速离心纯化）。

7、Polybrene慢病毒感染辅助试剂（6mg/ml，Sigma）。

8、293V培养基：DMEM高糖培养基+10%FBS；病毒培养基：DMEM高糖培养基+10%FBS，丙酮酸钠1mM。

（二）、简要实验流程

293V细胞铺板→转染质粒制备→收集病毒上清→纯化病毒

（三）、实验前准备

质粒准备：Cas9表达慢病毒载体和包装载体需要用无内毒素质粒提取试剂盒制备。制备方法请按照试剂盒的说明书进行。

包装细胞准备：包装慢病毒可以用HEK293、HEK293T或者我公司的293V细胞。293细胞的状态对病毒包装效率影响很大，请选用生长良好，无聚团现象的细胞进行病毒包装。

（四）、病毒制备步骤

概述： 
以下采用我公司的Polyfect-V转染试剂（货号P2010）为例说明慢病毒包装过程。您也可以采用其它品牌转染试剂进行慢病毒包装。转染试剂和质粒用量请参考生产厂家的说明书，也可以通过预实验决定。无论采用哪种转染试剂，3种载体的相对比例应保持不变。
本例中病毒包装采用10cm培养皿。如需用其它规格细胞培养器皿进行转染和病毒包装，请根据细胞相对生长面积对培养液体积和转染试剂用量进行相应调整。

1、转染前24小时，将293V细胞以4-5×106/10cm平皿密度接种，加入10ml 293V培养基37℃，5% CO2培养。细胞转染前密度应达到80-90%。

2、漩涡震荡混匀Polyfect-V转染试剂。

3、准备2个离心管，按以下顺序分别制备质粒和转染试剂稀释液。

4、充分混匀。

5、将转染试剂稀释液（离心管2）加入质粒DNA溶液（离心管1）中，立刻充分混匀。注意加入顺序非常重要。

6、室温孵育转染混合液15分钟。

7、将1ml转染混合液逐滴加入步骤1准备的细胞培养皿，前后晃动培养皿，充分混匀。

8、37℃培养。

9、4-6小时后，用10ml新鲜的293V培养基换液。转染后24小时，用10ml病毒培养基换液。

10、转染后48小时收集细胞培养上清。

11、病毒上清可以直接用于感染目的细胞或者浓缩纯化后感染目的细胞。推荐通过超速离心纯化、PEG6000浓缩纯化或者超滤法浓缩后再感染目的细胞。

12、病毒纯化后可以冻存在-80℃以备以后使用。

注意：

1、Cas9蛋白的基因长4kb，Cas9表达慢病毒的包装效率和感染力比一般慢病毒低，推荐经过浓缩纯化再用于感染目的细胞。

2、Cas9基因较大，包装时产生的空壳病毒（即有病毒外壳，但没有组装进目的基因的病毒）比较多。感染细胞时，这些不正确的病毒会竞争细胞表面受体，造成正确病毒感染率下降。密度梯度离心能去除病毒空壳，因此采用密度梯度离心纯化病毒可以显著提高病毒感染效果。如果没有时间进行超速离心，用PEG纯化法或者超滤纯化对提高提高病毒感染效果有一定帮助。

（五）、 PEG纯化慢病毒

以我们的PEG慢病毒纯化试剂为例进行慢病毒纯化浓缩。您也可以采用超速离心或者超滤法进行病毒浓缩。

所需试剂、耗材和仪器：冷冻离心机（50ml或15ml容量）；0.45μm过滤器（推荐使用Millipore低蛋白结合滤膜PES或PVDF）；无菌PBS溶液。 
操作步骤

1、收集病毒上清液，室温500g离心10分钟，去除细胞碎片，将病毒液转移到一个新的离心管中。

2、用0.45μm过滤器过滤病毒液。

3、将病毒液转移到新的离心管，保证病毒液体积不超过离心管容积的2/3。准确计量病毒液体积，每10ml病毒液加入PEG慢病毒纯化试剂4.7ml。

注意：PEG慢病毒纯化试剂比较粘稠，需要缓慢吸取，缓慢加入。保持病毒液和纯化试剂体的精确体积比非常重要。

4、反复颠倒混匀，直到病毒液和纯化试剂完全混合。4℃沉淀1.5小时，每0.5小时将混合液反复颠倒混匀1次。（可将病毒混合液放置在冰水混合物中，或者4°冰箱进行沉淀）。

5、沉淀完成后病毒混合液应该变浑浊。4℃，7000g，10min离心病毒混合液。离心后可见白色沉淀。去除上清。

6、将离心管倒置在滤纸上，去除残留液体。用原病毒液体积1/20的PBS重悬沉淀。分装用-80℃冻存。

三、稳转细胞系筛选

1、 转染前24小时将293T以适当密度铺板到12孔板。感染病毒时细胞密度在80%左右。
2、 取出制备好的Cas9表达慢病毒（pLV-Cas9-Puro包装得到，制备方法见Cas9慢病毒包装实验），室温融化。按照下面的方法准备慢病毒感染液：
以感染1个12孔板细胞（细胞培养基体积1ml）为例
 病毒液 50ul
 细胞完全培养基到950ul
 加入Polybrene到终浓度为6ug/ml
3、 用病毒感染液替换原细胞培养基，继续培养24小时。用新鲜的培养基替换病毒感染液。
4、 病毒感染48小时后，转入的基因开始表达。这时可以加入嘌呤霉素至终浓度为3ug/ml。
5、 在筛选过程中为维持抗生素合适的浓度和细胞营养，每隔2-3天应该换液一次，去除死细胞，补加抗生素。
6、 大约6-7天，细胞不再死亡。扩大培养筛选得到的细胞，进行检测。

四、PCR检测细胞基因组中的Cas9基因

用基因组PCR检测293T-Cas9细胞中的Cas9基因。 

鉴定引物：
Cas9-F：ACAGTCTTCACGAGCACATC
Cas9-R：TCCTCTTCATCCTTTCCCTA
产物大小198bp

步骤：

1、 分别提取293T-Cas9细胞和293T细胞的基因组DNA。
2、 PCR扩增
反应体系：
2×Taq Mix 25ul
Cas9-F（10uM）2ul
Cas9-R（10uM）2ul
基因组模板 5ul
加水补足50ul

反应条件：95℃ 预变性5min；95℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 30sec，35个循环。
3、 电泳检测PCR产物

M：DL2000 DNA marker
1：293T-Cas9扩增产物
2：293T扩增产物

五、 用pTYNE载体验证Cas9过表达细胞系

实验原理

pTYNE载体在EGFP编码框上游有2个错码的ATG起始密码子，由于不能有效地启动EGFP表达，pTYNE转染细胞仅能发出很微弱的荧光。我们根据pTYNE载体上错码的EGFP的上游区域设计并构建了Cas9蛋白基因敲除实验的阳性对照gRNA表达载体pGR-Hygro-P。
pTYNE载体和阳性对照gRNA表达载体共转染Cas9表达细胞，gRNA指引Cas9蛋白对pTYNE载体上的错码EGFP基因切割。细胞对断裂的DNA进行修复，产生正确的EGFP基因，发出明亮的绿色荧光。
通过pTYNE载体实验可以检测Cas9蛋白表达细胞系是否构建成功。

pGR-Hygro-P阳性对照载体靶序列：CTTCGAATTCTGCAGTCGA。该靶点位于pTYNE EGFP基因上游。

pGR-Hygro-N阴性对照载体靶序列：ATCGACTAGCCACTCAGAC。该序列为随机序列。

pGR-Hygro-P靶点在pTYNE载体上的位置:

Cas9切割原理:

pGR-Hygro载体图谱：

实验内容

1、实验材料

pTYNE质粒（验证载体，无内毒素试剂盒制备；货号：CR1011）

pGR-Hygro-P质粒（阳性对照，无内毒素试剂盒制备；货号CR1022）
pGR-Hygro-N质粒（阴性对照，无内毒素试剂盒制备；货号CR1022）
Cas9蛋白表达293T细胞系（货号：C1203）

Polyfect-V转染试剂（货号：P2010-1）

2、实验步骤

1) 转染前24小时将293T-Cas9铺到24孔板中。同时准备2个孔。
2) 按照下列体系制备2个质粒稀释液