N6-甲基腺苷（m6A）是高等真核生物信使RNA（mRNA）内部最丰富的修饰，与人类的发育，免疫，肿瘤生成和转移，干细胞更新，脂肪分化等过程息息相关，目前m6A甲基化修饰已成为科研中一个重要且热门的研究方向，因此，开发m6A甲基化的检测方法也尤为重要。

甲基化RNA免疫共沉淀高通量测序(MeRIP-seq/m6A-seq)是目前研究m6A甲基化修饰使用最广泛的技术之一。该技术利用特异性识别m6A甲基化修饰的抗体，对细胞内具有m6A甲基化修饰的RNA片段进行免疫共沉淀。然后，对沉淀下来的RNA片段进行高通量测序，并结合生物信息学分析，以在全基因组范围内系统研究m6A甲基化修饰的情况。尽管MeRIP-seq是一种广泛应用的技术，但因其受到输入量、抗体特异性、交联效率、非定量读数等因素影响，MeRIP-seq很难实现对m6A甲基化修饰全转录组无偏好检测和绝对定量。

随着技术的不断进步和创新，有一种更加准确、可靠和高效的m6A甲基化修饰检测技术出现了，即E. coli tRNA-specific adenosine deaminases（TadA）酶辅助的m6A测序技术（eTAM-seq）。

TadA是一种来源于大肠杆菌的腺嘌呤脱氨酶，自然界中野生型TadA可对单链RNA（ssRNA，主要是转运RNA（tRNA）内的环区）或双链RNA（dsRNA）的腺嘌呤脱氨，对DNA无脱氨活性。TadA可以在tRNAArg的单链反密码子环中将A转化为I，I在DNA的修复和复制过程中被读为G。TadA经蛋白改造后重组表达而来的突变体，也可以用于ssDNA的腺嘌呤高效脱氨。

eTAM-seq

在《Nature Biotechnology》杂志上，芝加哥大学化学系的汤玮欣教授、陈梦洁教授和何川教授共同发表了一篇名为“Transcriptome-wide profiling and quantification of N6-methyladenosine by enzyme-assisted adenosine deamination”的文章。该研究报道了一种基于TadA酶辅助的m6A测序技术（eTAM-seq），利用了TadA酶的特性，能够以单碱基分辨率对m6A进行准确的定量分析。相较于传统方法，该方法能有效保持RNA样本完整性，另外仅需要极少量的RNA样本，便能够实现对m6A甲基化修饰的精确检测和定量分析，为表观转录组破译提供了新方法。

eTAM-seq测序原理与实验流程

eTAM-seq技术通过对未被甲基化修饰的A进行脱氨反应转化成I，I能与C配对，在经过聚合酶链反应（PCR）反应后变为G，而甲基化修饰的m6A保留了其甲基化状态，仍被检测为A，从而识别出转录组中的m6A修饰。具体实验流程如下：

 01 

poly A尾去除

将RNA与oligo-dT进行退火处理，使用RNase H特异性消化RNA的poly A尾。

02 

RNA打断、末修及3’接头连接

对RNA进行片断化处理，随后使用T4 PNK进行末端修复，最后利用T4 RNA ligase 2在RNA3’端连接接头。

03 

TadA脱氨处理

未被甲基化修饰的A进行脱氨反应转化成I，甲基化的A保持不变。

04 

cDNA合成及5’接头连接

将脱氨酶处理后的RNA与RT引物退火，利用MMLV逆转录酶合成cDNA，随后利用T4 RNA ligase 1在cDNA的5’端连接接头。

05 

PCR扩增及测序

eTAM-seq技术的高准确性、稳定性以及单碱基分辨率等特性，使其在进一步优化并推广至单细胞水平的检测中具有巨大的潜力。但eTAM-seq的核心原料TadA目前无商业化产品，限制了其应用，翌圣紧跟科研前沿，借助翌圣镁孚泰生物ZymeEditor（点击了解更多）酶改造及发酵、纯化工艺平台成功开发了TadA脱氨酶（Cat#14556ES），并可提供eTAM-seq的相关酶原料，助力新技术研发及转化。经过多家顶尖工业与科研机构客户验证，本产品在eTAM-seq应用中展现出卓越的性能表现。

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参考文献

[1] Tang J, Chen S, Jia G. Detection, regulation, and functions of RNA N6-methyladenosine modification in plants. Plant Commun. 2023;4(3):100546.

[2] Xiao YL, Liu S, Ge R, et al. Transcriptome-wide profiling and quantification of N6-methyladenosine by enzyme-assisted adenosine deamination.