细胞样本的前处理

    一、匀浆介质

    一般采用0.05mol/LTris-HCl,pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS),客户可根据样本及测定指标的情况自行设定浓度,目的是保持样本的等渗环境。

    二、细胞样本的前处理:

    1、细胞沉淀的收集：

    ①悬浮细胞:对于悬浮培养的细胞，直接通过离心收集细胞沉淀，将培养液在室温条件下1000转/分,离心10分钟，弃上清留细胞沉淀。

    ②贴壁细胞:对于贴壁培养的细胞，用胰酶将细胞消化下来，或用细胞刮将细胞刮下来，将培养液在室温条件下1000转/分,离心10分钟，弃上清留细胞沉淀。

    我们一般建议客户，细胞密度最好不要小于一百万个/ml。

    2、细胞沉淀的洗涤：

    在细胞沉淀中加入0.5-1ml的PBS（等渗），轻轻颠倒混匀，将培养液在室温条件下1000转/分,离心10分钟，弃上清留细胞沉淀。

    重复上述操作反复洗涤1～2次。

    3、匀浆的方式：手工匀浆，超声破碎,裂解液裂解,反复冻融。

    ①手工匀浆：在细胞沉淀中加入一定量的PBS（PBS的加入量根据所测指标的不同而有所改变，一般加入0.5ml，细胞密度不小于一百万个/ml），混匀，将细胞悬浮于PBS中，用移液器将细胞悬浮液移至玻璃匀浆管中（2ml玻璃匀浆管），将玻璃匀浆管置于冰水混合物中，手动匀浆3分钟，然后取破碎好的细胞悬浮液进行测定。

    ②超声破碎:

    在细胞沉淀中加入一定量的PBS（PBS的加入量根据所测指标的不同而有所改变，一般加入0.5ml，细胞密度不小于一百万个/ml），混匀，将细胞悬浮于PBS中，在冰水浴条件下进行如下操作:

    a、用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用400安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。

    b、用超声细胞破碎仪，300W功率，每次超声3～5秒，间隔30秒，重复4～5次。

    ③裂解液裂解

    常用裂解液有SDS、NP-40、TritonX-100,这三种去垢剂的作用是不同的，或者说作用力量强弱不同。

    1、SDS属于离子型去垢剂，最厉害，基本可以把细胞完全破掉，DNA会释放出来，裂解液变得很粘稠。

    2、NP-40是很温和的去垢剂，1%浓度的基本可以破坏掉胞膜，而对核膜破坏的作用弱，结合特定的buffer可以获得胞浆蛋白。

    3、TritonX-100的能力介于NP40和SDS之间，偏向于NP40，也是常用的细胞裂解液成分之一，在保护蛋白活性方面有一定作用（SDS基本会使蛋白变性失活）。

    去垢剂属性只是一方面，buffer、配比、浓度、提取方法和材料处理也都是关键因素

    由于很多裂解液都是蛋白变性剂,对酶活力的测定有一定的影响,一般不推荐用裂解液进行裂解。

    ④反复冻融:

    在细胞沉淀中加入一定量的PBS（PBS的加入量根据所测指标的不同而有所改变，一般加入0.5ml，细胞密度不小于一百万个/ml），混匀，将细胞悬浮于PBS中，放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右）。

    由于反复冻融对酶活力影响较大,一般不推荐使用.