2024年3月28日，华中科技大学同济医学院附属同济医院李锋教授团队在Cell Metabolism，IF 29上在线发表了题为“A clinical-stage Nrf2 activator suppresses osteoclast differentiation via the iron-ornithine axis”的研究成果，本研究确定了一种新型临床阶段Nrf2激活剂-Bitopertin，该激活剂通过Nrf2-铁鸟氨酸途径抑制破骨细胞分化并改善雌激素消耗诱导的骨质流失。在人类受试者中，该激活剂比现有的临床Nrf2激活剂具有更少的不良事件，表明Bitopertin可能是治疗骨质疏松症和其他Nrf2相关疾病的良好候选药物。

绝经后骨质疏松症是在缺乏雌激素的情况下由破骨细胞过度活化引起的代谢紊乱。骨密度(BMD)降低使患者更易患髋部或椎体脆性骨折，在全球范围内造成严重残疾和社会经济负担。通过小分子激活Nrf2是治疗绝经后骨质疏松症的一种很有前途的策略，然而，目前还没有批准用于治疗慢性疾病的Nrf2激活剂，且Nrf2调控破骨细胞分化的下游机制仍尚不清楚。

作者首先通过灌胃研究了bitopertin对OVX小鼠骨量的影响，发现bitopertin通过抑制体内破骨细胞形成来改善OVX诱导的骨质疏松症。进一步研究发现bitopertin在抑制破骨细胞分化和减轻OVX诱导的骨质疏松方面具有非甘氨酸依赖性的作用。为研究bitopertin的作用靶点，作者对MCSF-、RANKL-和bitopertin治疗的骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）进行了RNA测序。通过数据分析和实验验证推测Nrf2可能是介导bitopertin作用的核心调节因子，并检测Nrf2在mRNA和蛋白水平上的表达，发现bitopertin处理没有改变Nrf2的mRNA表达，但蛋白水平显著升高，而Nrf2抑制因子Keap1的表达未被bitopertin改变。体内组织免疫荧光分析显示，bitopertin处理小鼠股骨小梁Nrf2表达增加。通过计算机模拟分子对接分析以研究bitopertin对Keap1-Nrf2复合物的影响，发现两种蛋白之间的相互作用被bitopertin处理剂量依赖性地抑制。随后，免疫共沉淀和泛素化实验表明bitopertin治疗可减少Nrf2免疫沉淀的Keap1。Bitopertin处理后，Nrf2的泛素化水平降低，Nrf2的蛋白稳定性增加。这些数据表明，Bitopertin通过直接结合Keap1的Kelch结构域激活Nrf2，并降低Keap1-Nrf2相互作用。

接下来，作者使用Nrf2-/-小鼠进一步验证了Nrf2是Bitopertin的靶标，与WT小鼠相比，bitopertin并没有增加Nrf2-/-小鼠的骨小梁质量、骨参数和血清CTX水平。Nrf2敲除在体外促进破骨细胞分化，bitopertin对破骨细胞的抑制作用被消除。表明bitopertin对破骨细胞分化和OVX诱导的骨质流失的抑制作用是通过Nrf2激活介导的。接下来，作者比较了bitopertin与两种临床批准的亲电Nrf2激活剂OMA (30 mg/kg)和DMF (50 mg/kg)的疗效和安全性，发现与DMF、OMA或bardoxolone相关的任何不良事件或严重不良事件的发生率显著高于与bitopertin相关的不良事件，表明bitopertin可能是临床使用的更安全的Nrf2激活剂候选药。进一步探究Nrf2抑制破骨细胞分化的下游机制，发现Nrf2激活铁转运蛋白编码基因Slc40a1的转录，NFE2L2（编码Nrf2的基因）-SLC40A1轴在骨质疏松症患者的破骨细胞前体中受到抑制。

Slc40a1是哺乳动物细胞中唯一的铁转运蛋白的编码基因。RNA-seq数据的GSEA分析显示，在RANKL处理的Nrf2-/-和WT bmdm之间，铁的摄取和运输途径发生了显著变化。在RANKL治疗的BMDMs中，Nrf2激活剂bitopertin降低了细胞内铁，但在Nrf2-/- BMDMs中，这种降低是逆转的。随后，我们通过腺病毒shRNA敲除Slc40a1的表达，发现Slc40a1沉默减弱了bitopertin的降铁作用，表明Slc40a1是Nrf2调控破骨细胞铁代谢的重要效应因子。进一步探究铁代谢是否介导Nrf2对破骨细胞的影响，发现在OVX模型中，敲除BMDMs中的Nrf2可增加细胞内铁水平，激活破骨细胞分化，并加剧骨质流失。然而，DFO螯合铁可以逆转Nrf2敲除引起的破骨细胞过度活化和骨质流失。临床数据分析表明，铁含量过高会增加患骨质疏松症的风险。

最近的两项研究表明Nrf2和铁都可以调节核苷酸代谢，作者对DFO处理的Nrf2-/- BMDMs进行代谢组学分析，以研究Nrf21和铁调节的代谢途径。代谢产物KEGG分析表明，精氨酸和脯氨酸代谢途径是变化最显著的途径，热图显示，DFO处理后，该通路中大部分差异代谢物上调。由于鸟氨酸是一种上游代谢物，可以被代谢成许多其他代谢物，作者重点研究了鸟氨酸，发现DFO处理增加了鸟氨酸的丰度，降低了亚精胺的丰度。在WT BMDMs中，用bitopertin激活Nrf2可增加细胞内鸟氨酸水平；相反，Nrf2-/- BMDMs显示鸟氨酸水平下降，DFO治疗显著增加了Nrf2-/- BMDMs中鸟氨酸的水平，表明鸟氨酸是受Nrf2和铁调控的下游代谢物，影响破骨细胞分化。随后，作者探究了Nrf2和铁如何调节细胞内鸟氨酸水平，发现Nrf2-/- BMDMs抑制Odc1表达，阻止鸟氨酸向亚精胺的转化，导致鸟氨酸水平升高，Odc1受Nrf2和铁的调控，影响鸟氨酸代谢、破骨细胞分化和骨量。