动物按照一定的昼夜节律周期活动，进食周期使得动物有节律地暴露于食源性病原体。因此，动物的肠道先天免疫可能表现出昼夜节律，以抵抗随食物侵入宿主体内的病原物。目前对于微生物如何通过生物钟来调节肠道先天免疫还知之甚少。 2021年8月，来自美国德克萨斯大学西南医学中心的Lora V. Hooper研究团队在Cell （IF= 38.621）上发表题为《The microbiota coordinates diurnal rhythms in innate immunity with the circadian clock》的文章，该研究整合免疫学和微生物组技术探讨先天免疫周期调控的分子机制。该研究发现肠道菌群和生物钟协同产生肠道先天免疫的昼夜节律，动物的节律性进食促进在肠道表面分节丝状菌(segmented filamentous bacteria，SFB)周期性附着，并驱动上皮细胞STAT3周期性表达和激活，从而促进上皮细胞节律性分泌抗菌蛋白(antimicrobial proteins，AMPs)。 【研究材料】 ● CV小鼠，conventional，普通小鼠 ● GF小鼠，germ-free，无菌小鼠 ● Tac小鼠，从Taconic Farms公司获得的小鼠，肠道中含有SFB菌； ● Jax小鼠，从Jackson实验室获得的小鼠，肠道中不含SFB菌； ● 其他基因敲除小鼠。 【技术方法】 16S rDNA测序+细胞因子检测 🔹 步骤1：分析肠道菌群对免疫蛋白节律性表达的影响 🔹 步骤2：电镜分析锁定肠上皮细胞附着的关键菌SFB 🔹 步骤3：遗传学实验与细胞因子检测发现SFB菌通过ILC3-STAT3信号轴调控免疫节律 🔹 步骤4：16S测序证实生物钟通过进食节律驱动肠道先天免疫节律形成 🔹 步骤5：SFB菌相关的免疫节律调控小鼠对沙门氏菌耐受性 1. 抗菌蛋白表达的免疫昼夜节律取决于肠道菌群 研究者通过分析肠上皮细胞抗菌蛋白表达情况，发现普通小鼠（CV）存在免疫节律而无菌小鼠（GF）没有免疫节律。研究者分析了抗菌蛋白REG3G的表达，该蛋白由小肠上皮分泌，能够杀死革兰氏阳性菌、抑制黏液层的细菌定植。结果表明，普通小鼠Reg3g基因及其编码蛋白REG3G的表达具有显著昼夜节律性，而无菌小鼠则始终在较低的表达水平，无节律性。其他抗菌蛋白LCN2、S100A8等也有类似情况，在普通小鼠中表现出节律性，而在无菌小鼠中失去了节律表达特征。总之，抗菌蛋白的节律性表达依赖于肠道菌群的存在。 图1 抗菌蛋白昼夜表达特征 2. 分节丝状菌（SFB）周期性黏附驱动上皮细胞抗菌蛋白节律性表达 为了发现驱动抗菌蛋白节律性表达的微生物，研究者通过扫描电镜观察了小鼠小肠，结果发现上皮细胞大量附着有一类呈节段的丝状菌，这是分节丝状菌（SFB）的独特形态。比较发现，含有SFB菌的小鼠表现出REG3G抗菌蛋白节律性表达，而不含SFB菌的小鼠则无此特征。将SFB菌接种到无菌小鼠后，也能促进小鼠节律性表达该抗菌蛋白。以上结果表明是分节丝状菌驱动了上皮细胞节律性表达抗菌蛋白REG3G。 图2 分节丝状菌刺激抗菌蛋白节律性表达 3. SFB菌通过ILC3-STAT3信号轴调控REG3G的节律性表达 为了探究SFB菌驱动REG3G节律性表达的调控信号轴，研究者选取了多个已报道的REG3G上游调控基因，观察敲除后对REG3G表达节律的影响。结果表明，REG3G的表达与多种免疫细胞有关，通过对细胞因子Elisa检测发现CD11c+髓样细胞通过TLR受体-MYD88信号轴感知免疫原并启动白介素IL-23，之后IL-23激活先天淋巴样细胞(ILC3)并合成白介素IL-22，IL-22最后激活肠上皮细胞STAT3并启动REG3G合成。此外IL-23和IL-22也存在节律性的变化。这些结果进一步明确了ILC3-STAT3信号轴对REG3G节律性表达调控作用。 图3 MYD88、STAT3对REG3G节律性表达的影响 4. 生物钟通过进食节律驱动肠道先天免疫节律形成 生物钟是如何调控STAT3和REG3G表达对SFB菌的响应呢？作者敲除小鼠生物钟组分发现，REG3G表达并不受生物钟转录因子REV-ERBα的调控，而受到BMAL1/CLOCK的调控。ClockΔ19/Δ19突变小鼠的自由采食变得没有节律，结果导致SFB菌引起的节律性响应也显著减弱。研究者将ClockΔ19/Δ19突变小鼠限制进食，形成白天或夜间规律进食，这促使SFB菌重新形成节律，且SFB菌附着高峰总是形成在进食后，促进REG3G和pSTAT3重新形成表达节律。随后研究者将该批小鼠禁食一天，这导致SFB菌附着数量显著降低，16S rRNA测序分析也证实SFB菌拷贝数降低，REG3G和pSTAT3节律随之消失。以上结果表明，生物钟能够调节小鼠规律进食，从而促进SFB菌节律性附着到肠上皮，进而驱动STAT3、pSTAT3和REG3G表达节律形成。 图4 进食节律与免疫蛋白REG3G的表达调控 5. SFB菌相关的免疫节律调控小鼠对沙门氏菌耐受性的周期变化 以上对肠道先天免疫昼夜节律的研究表明，宿主对病原物感染的抵抗力可能随昼夜周期而变化。为了验证这一点，研究者分析了小鼠在不同时间点感染鼠伤寒沙门氏菌的免疫差异。首先分析具有免疫节律的SFB+小鼠感染鼠伤寒沙门氏菌的情况，在ZT12时间点接种后的病菌载量显著高于ZT0时接种后的载量，ZT12时间点的致死率高于ZT0时间点的接种小鼠。而SFB-小鼠则未表现出免疫节律，对沙门氏菌的感染未出现差异。这表明肠道先天免疫节律使得小鼠对沙门氏菌感染的免疫力也出现节律性变化。 图5 小鼠对沙门氏菌感染耐受性的周期变化 小编小结 环境中的光循环会影响动物的昼夜节律进食行为，使得动物暴露与食源性病原菌，因此动物需要一种机制来应对这一挑战。该研究结合免疫学、遗传学、微生物组等方法和技术，探讨了生物钟调控肠道中先天免疫的节律性应答机制。该研究发现，动物的节律性进食促进SFB菌在肠道上皮细胞的周期性附着，并激活ILC3-STAT3信号轴周期性振荡，触发上皮细胞节律性合成和分泌抗菌蛋白，形成肠先天免疫的节律性。本研究发现宿主进食节律与微生物群周期的关系，证实了生物钟促进肠道先天免疫节律形成的分子机制，研究成果为深入探究免疫昼夜节律的调控机制提供新的视角。
实验路线图
研究结果
肠道微生物也会打卡上下班 | Cell 揭示肠道免疫的昼夜节律调控机制
作者：上海中科新生命生物科技有限公司 2021-12-23T18:39 (访问量:2939)
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