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D-荧光素

原理

D-荧光素（D-Luciferin）是荧光素酶（Luciferase）的常用底物，普遍应用于整个生物技术领域，尤其是体内活体成像技术。其作用机制是在ATP和荧光素酶的作用下，荧光素（底物）能够被氧化发光。当荧光素过量时，产生的光量子数与荧光素酶的浓度呈正相关性（见下图）。

将携带荧光素酶编码基因（Luc）的质粒转染入细胞后，导入研究动物如大、小鼠体内，之后注入荧光素，通过生物发光成像技术（BLI）来检测光强度变化，从而实时监测疾病发展状态或药物的治疗功效等。也可以利用ATP对此反应体系的影响，根据生物发光强度的变化来指示能量或生命体征。

分类

使用方法

（1）体外实验：

a：储存液配置：将1 g的荧光素钠盐或钾盐溶解于33.3 ml水中，制备成30 mg/ml的储存液。混匀，0.2μm滤膜过滤（可吹入惰性气体，如氮气，以防止氧化。）-80℃避光保存，一年内有效。

b：使用：①在冰上避光解冻（若是在冰上比较难解冻，可短暂温浴，并轻柔混匀）。②用培养基以1:200的比例稀释储存液为150μg/ml。③去除培养细胞的培养基直至无残留。④待图像分析前，向细胞内添加1×荧光素工作液，然后进行图像分析（或者细胞放在37℃短时间孵育约5min后检测可增强信号）

（2）活体成像：

a：工作液配置：①溶解1 g荧光素钾盐或钠盐于66.6 ml 无Ca²⁺和Mg²⁺的DPBS中，配置成15 mg/ml的溶液。②混匀，0.2μm滤膜过滤（可吹入惰性气体，如氮气，以防止氧化。）-80℃避光保存，一年内有效。

b：使用：①在冰上避光解冻（若是在冰上比较难解冻，可短暂温浴，并轻柔混匀）。

②按照动物体重150 mg/kg进行注射，（例如，20 g重的小鼠需要注射200μl ）

③注射入体内10-20 min（待光信号达到最强稳定平台期），再进行成像分析。

注：建议对每只动物模型都需要建立荧光素酶动力学曲线，从而确定最高信号检测时间和信号平台期。

注射方法

（1）腹腔注射：

将底物注射入腹腔中。推荐剂量为150 mg/Kg（例如，20 g重的小鼠需要注射200μl ）。使用25 G的针头，1 ml注射器。

其方法如下示意图：

进针5 mm，斜向上30^°角。

（2）静脉注射：

小鼠的静脉注射通常是在小鼠的尾部或者眼眶静脉注射。静脉注射的推荐剂量同腹腔注射，150 mg/Kg。注射液体的最大体积不可超过血容量的10%。一般对于20 g 小鼠其血容量为2 ml，故其最大注射量应为200μl。使用1 ml注射器26 G针头，或者使用胰岛素注射器28 G针头，确保注射器中无气泡。注射前将动物置于加热灯下约5 min，或者将尾巴浸泡于温水中以扩张血管。操作时将小鼠固定于鼠筒或者烧杯中，乙醇消毒尾部，缓慢注射。

客户实例

TIPE2抗炎因子在乳腺癌动物模型中的抗肿瘤治疗作用

选自文献：Zhang Z, Li L, Cao S, et al. Gene delivery of TIPE2 inhibits breast cancer development and metastasis via CD8 +, T and NK cell-mediated antitumor responses[J]. Molecular Immunology, 2017, 85:230.

FAQ

Q1: 荧光素的纯度对实验有成影响吗？

A：有影响。99%以上的纯度较好。

Q2: 甲虫荧光素和萤火虫荧光素之间有区别吗？

A：二者之间没有区别。

Q3: 如何溶解荧光素，其溶液稳定吗？

A：荧光素钾盐在水中的溶解度为60 mg/ml，荧光素钠盐溶解度为100 mg/ml。荧光素游离酸是不溶于水的，但是在甲醇中的溶解度为10 mg/ml，在DMSO中溶解度为50 mg/ml。

荧光素钠盐和钾盐的水溶液短期内存放于-80℃，对实验效果没有明显影响。有实验证明，将荧光素溶解于脱氧中的水中会更稳定些。

对于一些较为敏感的试验，为了控制试验中的可变因素，较推荐新鲜配置的反应液 。例如，低浓度的荧光素酶或者并非最适的反应条件是需要高质量的底物才能进行反应  。

Q4: 荧光素钠盐和荧光素钾盐有什么区别？

A：目前的研究没有发现二者在使用效果上的区别，仅在物理特征上有些小的差别，如荧光素钠盐溶解度会高于荧光素钾盐。但是在体内实验研究中，有更多的研究者倾向于选择荧光素钾盐，据不完全统计，选用钾盐的使用人是钠盐使用人的3倍。

Q5: 荧光素钠盐，荧光素钾盐，和荧光素游离酸之间有什么区别？

A：游离酸不溶于水，在甲醇中的溶解度为10 mg/ml，在DMSO中溶解度为50 mg/ml，同样可用 NaOH，KOH弱碱去调节溶液的PH值。荧光素的钠盐或者钾盐在使用过程中会更方便，尤其是在体内成像实验中，因其能够溶解在水中，反应毒性也会更小些。

Q6: 为什么溶解荧光素钠盐或者钾盐的时候需用不含Ca²⁺或Mg²⁺离子的PBS，有无别的盐溶液可用来溶解荧光素？

A：PBS，或者其他的磷酸盐缓冲液，或DPBS，常用来进行生物学研究或者细胞相关研究。PBS/DPBS为等渗溶液，PH为7.2-7.6之间。DPBS和PBS之间无差别，只是通常情况下，DPBS是不含钙镁离子。钙镁离子可能会抑制某些蛋白酶的活性。此外Mg²⁺是催化荧光氧化的重要因素，Ca²⁺是和腔肠素氧化有关的离子。其他的盐溶液也可用来溶解荧光素，但要避免溶液中的阳离对实验造成影响。

Q7: 荧光素酶的发光特性？

A：荧光素腹腔注射老鼠后约1 min后，能够表达荧光素酶的细胞开始发光，10 min后强度达到稳定的最高点，在最高点持续约20-30 min后开始衰减，约3 h后荧光素排除，发光全部消失，最好的检测时间是在注射后15-35 min内。其动力学曲线如下图：

Q8: 怎么将荧光素注入小鼠体内，注射方法之间的区别是什么？

A：荧光素可通过腹腔注射或尾部静脉注射注入小鼠体内。约1 min可扩散到小鼠全身。大部分情况下使用荧光素浓度为150 mg/kg。对于20 g的小鼠约使用3 mg的荧光素即可。对于腹腔注射来讲，扩散较慢，开始发光较慢，持续发光时间较长。对于荧光素的尾部静脉注射，扩散快，开始发光快，但发光持续时间较短。

Q9: 荧光素底物可以透过血脑屏障吗？

A：荧光素底物约280道尔顿，荧光素的水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透细胞膜和血脑屏障。

Q10: 荧光素酶的表达稳定性如何？

A：通过稳定筛选等过程，荧光素酶基因是能够插到细胞染色体内的。当细胞进行分裂、转移、分化时，荧光素酶也得到持续稳定的表达，荧光素酶的半衰期约为3 h，故只有活细胞才能持续表达荧光素酶。

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